Untersuchungen zur pH-Wert-Abhängigkeit des lysosomalen integralen Membranproteins Typ 2 als Transportrezeptor

Zachos, Christina

In der vorliegenden Arbeit wurde eine eingehende Charakterisierung der pH-Wert-abhän-gigen Interaktion des lysosomalen integralen Membranproteins Typ 2 (LIMP-2) zu seinem Liganden β-Glukocerebrosidase auf zellulärer sowie molekularer Ebene vorgenommen. In Interaktions- und Immunfluoreszenzstudien konnte gezeigt werden, dass die beiden Interak-tionspartner stärker aneinander binden, wenn der lysosomale pH-Wert zuvor erhöht wurde. Außerdem ließ sich zeigen, dass fehlsortierte LIMP-2-Mutanten im pH-neutralen Milieu des ERs vielfach stärker an die β-Glukocerebrosidase binden als lysosomal lokalisierte LIMP-2-Varianten. Zudem konnte nach erfolgreicher Eingrenzung der für die β-Glukocerebrosidase-Bindung nötigen LIMP-2-Region der LIMP-2-Histidinrest 171 als ein wichtiger Rest für die pH-sensitive Interaktion beider Proteine identifiziert werden. Histidinreste liegen nur unterhalb von pH 6,0 protoniert vor und eine Abstoßung der β-Glukocerebrosidase würde dem-nach nur in den Endosomen und Lysosomen stattfinden. Die Mutation des Histidins 171 zu einem nicht protonierten Alanin führte zu einer verstärkten Bindung der β-Glukocerebrosidase, während sein Austausch zu einem konstant protonierten Lysin eine verstärkte Abstoßung und eine damit verbundene anteilige ER-Retention sowie eine Verringerung der Enzym-aktivität der β-Glukocerebrosidase zur Folge hatte. Demnach konnte auch auf zellulärer Ebene eine pH-Wert-Abhängigkeit der LIMP-2/ β-Glukocerebrosidase-Interaktion bestätigt werden und gleichzeitig ein möglicher Regulationsmechanismus durch den Histidinrest 171 gezeigt werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit war es möglich, eine Hypothese zur Funktionalität einer beob-achteten LIMP-2/ (Pro)Renin Rezeptor-Interaktion aufzustellen. Der sowohl vesikulär sowie an der Plasmamemebran lokalisierte (Pro)Renin Rezeptor ist als akzessorische Untereinheit der vesikulären H+-ATPase wichtig für die Azidifizierung Wnt-Signal-induzierter Endosomen und ist daher essentiell für die Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalweges. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass möglicherweise auch LIMP-2 eine regulatorische Rolle im Wnt-Signalweg spielt. So zeigte sich in durchgeführten Membranpräparations- und Luciferase-Reportergen-Experimenten, dass LIMP-2-defiziente Zellen eine gesteigerte Sensitivität ge-genüber Wnt-Stimulation aufwiesen, die durch die Retransfektion von LIMP-2 wieder aufge-hoben werden konnte.

In this study the pH-dependent interaction of the lysosomal integral membrane protein type 2 (LIMP-2) and its ligand β-glucocerebrosidase was characterised on a cellular and molecular level. Interaction and immunfluorescence studies revealed a stronger interaction of both binding partners when the lysosomal pH was increased. It could also be shown that all inves-tigated ER-resident LIMP-2-mutants showed a stronger binding to the β-glucocerebrosidase under neutral ER conditions. After narrowing down the LIMP-2 region, important for its interaction with the β-glucocerebrosidase, the highly conserved histidine 171 was identified as a putative regulating residue in the pH-dependent interaction of both proteins. Histidines are only protonated under pH 6.0 and repulsion of the β-glucocerebrosidase would only take place in the endo-/ lysosomal compartment. The mutation of histidine 171 to a non-proto-nated alanine caused a strong interaction of LIMP-2 and the β-glucocerebrosidase whereas substitution to an instantly protonated lysine led to an early repulsion and a slight ER-retention of the enzyme. Thus, reduced binding capacity caused a partial mistargeting and reduced enzyme activity of β-glucocerebrosidase. In conclusion, this study revealed the pH-dependent interaction of LIMP-2 and the β-glucocerebrosidase on a cellular level and presented the histidine 171 within the LIMP-2 protein as a regulating amino acid in this regard. The second part of this thesis presented a possible reason for an observed interaction of LIMP-2 and the (pro)renin receptor. The vesicular and plasma membrane localised (pro)renin receptor is an accessory binding partner of the vesicular H+-ATPase. Both are important for a wnt-induced acidification of signaling endosomes and thus are necessary for the activation of the wnt-/ β-Catenin signaling pathway. It could be shown that LIMP-2 might also play a regulatory role in the wnt-/ β-Catenin signaling pathway as membrane prepa-rations and luciferase reporter gene experiments revealed that LIMP-2-deficient cells showed a high susceptibility to wnt-stimulation that could be diminished after retrans-fection of LIMP-2.

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Zachos, Christina: Untersuchungen zur pH-Wert-Abhängigkeit des lysosomalen integralen Membranproteins Typ 2 als Transportrezeptor. 2012.

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