Strukturelle und funktionelle Untersuchung des lysosomalen integralen Membranproteins LIMP-2

Groth, Johann

Das lysosomale integrale Membranprotein Typ 2 (LIMP-2) wurde kürzlich als Transportrezeptor der lysosomalen Hydrolase β-Glucocerebrosidase (β-GC) identifiziert. Der Zusammenhang zwischen Struktur und Funktion von LIMP-2 sowie die Interaktion mit β-GC ist bisher allerdings nicht näher untersucht worden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher den Einfluss der Glykosylierung auf Faltung, Strukturintegrität und Transport des LIMP-2 Proteins zu analysieren. Dies sollte erste Informationen hinsichtlich der LIMP-2 Struktur liefern. Verschiedene biochemische Methoden wie Mutagenese-Studien, Deglykosylierungs-experimente mit PNGaseF und EndoH sowie deren Auswertung mittels Western-Blot Techniken wurden dazu verwendet, um die Bedeutung einzelner potentieller N-Glykosylierungsstellen offenzulegen. Die lysosomale Lokalisation der entsprechenden LIMP-2 Glykosylierungsvarianten wurde mittels indirekter Immunfluoreszenz überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass neun der elf potentiellen N-Glykosylierungsstellen von LIMP-2 glykosyliert vorliegen. Sowohl die nicht konservierte N-Glykosylierungsstelle N122 als auch die unmittelbar vor der C-terminalen Transmembrandomäne gelegene N-Glykosylierungsstelle N430 werden nicht genutzt. Das LIMP-2 Protein selbst ist auf eine korrekte N-Glykosylierung angewiesen. Insbesondere eine Glykosylierung des Asparagins N68 ist essentiell, alleine aber nicht hinreichend. Der Glykosylierungsstatus von LIMP-2 und die beobachtete EndoH Sensitivität einzelner N-Glykosylierungsstellen stehen in keinem Zusammenhang mit der β-GC Interaktion. In weiteren Experimenten, unter anderem in Crosslink-Studien, konnte die Ausbildung eines LIMP-2 Homo-Dimers nachgewiesen werden. Weiterhin konnte für die Interaktion von LIMP-2 und β-GC ein 1:1 Verhältnis gezeigt werden. Die Überexpression der luminalen LIMP-2 Domäne als Sekretionsprotein in HEK-6E Zellen führte zur Ko-Sekretion endogener und ko-exprimierter β-GC. Neben einem nativen LIMP-2 / β-GC Komplex konnten zum Großteil nur artifiziell verknüpfte LIMP-2 / β-GC Komplexe gereinigt werden. Die Bedeutung der coiled-coil Domäne von LIMP-2 für die Vermittlung der β-GC Interaktion konnte durch die Präzipitation rekombinanter β-GC durch ein isoliertes LIMP-2 coiled-coil Peptid bestätigt werden. Abschließend konnte auch die Tertiärstruktur des coiled-coil Motives aufgeklärt werden. Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse stellen somit die Grundlage für zukünftige Strukturanalysen dar, die dann zur vollständigen LIMP-2 Strukturaufklärung führen könnten.

The lysosomal integral membrane protein type 2 (LIMP-2) has recently been identified as a transport receptor of the lysosomal hydrolase β-glucocerebrosidase (β-GC). The relationship between structure and function of LIMP-2 as well as the interaction with of LIMP-2 with β-GC has not yet been investigated in detail. The goal of this study was to analyze the influence of glycosylation on folding, the structural integrity and trafficking of the LIMP-2 protein. This should provide preliminary information regarding the structure of LIMP-2. Several biochemical approaches such as mutagenesis studies, deglycosylation assays with PNGaseF and EndoH and their subsequent analysis by Western blot techniques were used to reveal the importance of individual potential N-glycosylation sites. The lysosomal localization of the corresponding LIMP-2 glycosylation variants was analyzed by indirect immunofluorescence. It was shown that nine of the eleven potential N-glycosylation sites of LIMP-2 are glycosylated. Both the non-conserved N-glycosylation site N122 and the immediately prior to the C-terminal transmembrane domain located N-glycosylation site N430 are not modified by glycosylation The LIMP-2 protein itself is dependent on correct N-glycosylation. In particular, glycosylation of asparagine N68 is essential but does not suffice on its own. The glycosylation status of LIMP-2 and the observed EndoH sensitivity of individual N-glycosylation sites are apparently not associated with β-GC interaction. In further experiments, including cross-link studies, the formation of a LIMP-2 homodimer was identified. Furthermore the interaction of LIMP-2 and β GC was found to be present in a 1:1 ratio. Over-expression of the luminal LIMP-2 domain as a secretory protein in HEK-6E cells led to co-secretion of endogenous and co-expressed β-GC. Apart from a native LIMP-2/β-GC complex, mainly artificially linked LIMP-2/β-GC complexes were purified. The importance of the LIMP-2 coiled-coil domain for the mediation of β-GC interaction was confirmed by precipitation of recombinant β-GC by an isolated LIMP-2 coiled-coil peptide. Finally, the tertiary structure of the coiled-coil motif was elucidated. The insights gained from this study represent the basis for future structural analyses, which could then lead to the complete protein structure determination of LIMP-2.

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Groth, Johann: Strukturelle und funktionelle Untersuchung des lysosomalen integralen Membranproteins LIMP-2.

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