Flavonoide als potentielle Inhibitoren des darmständigen Natrium-abhängigen Glucose-Cotransporters 1 (SGLT1)

Schwanck, Bettina

Diabetes mellitus ist eine der häufigsten Stoffwechselerkrankungen, wobei es sich bei etwa 90% aller Diabetesfälle weltweit um Typ-2-Diabetes handelt. Jährlich erkranken etwa 270 000 Menschen allein in Deutschland neu an Diabetes-Typ-2. Hauptaufgabe des vom BMBF geförderten Projektes „Der Glucose Transporter SGLT: Schlüsselmolekül zur Prävention von Diabetes mellitus?“ waren Untersuchungen zur Inhibition des darmständigen Natrium-abhängigen Glucose-Cotransporters (SGLT1) durch Flavonoide. Natrium-abhängige Glucose-Cotransporter sind in der apikalen Bürstensaummembran des Dünndarms zu finden (SGLT1), aber auch im proximalen Tubulus der Niere (SGLT2). Zurzeit steht die Entwicklung von selektiven SGLT2-Inhibitoren im Fokus der Diabetes-Forschung. Der SGLT2 ist hauptverantwortlich für die Reabsorption der Glucose aus dem Primärharn. Phlorizin, ein Dihydrochalcon aus Apfel und bekannter kompetitiver Inhibitor von SGLT1 und 2, fungierte als Modellsubstanz für die Suche von selektiven SGLT2-Inhibitoren, aber auch von SGLT1-Hemmstoffen. Die Inhibition des SGLT1 im Darm und die damit einhergehende Verminderung der Glucoseabsorption könnte eine zusätzliche Strategie besonders in der Prävention von Diabetes mellitus sein. So könnten bei beginnendem Diabetes problematische postprandiale Glucosespitzen verringert werden, ohne dass Flavonoide dazu intestinal absorbiert werden müssen. Im Rahmen des Kooperationsprojektes wurden über 50 polyphenolische Substanzen sowie unterschiedliche flavonoidhaltige Pflanzenextrakte in in vitro- und in vivo- Testsystemen auf ihre Inhibitionsfähigkeit des SGLT1 untersucht. Im Oozytenmodell mittels ‚two-electode-voltage-clamp‘ gemessen, inhibierten neben Phlorizin (IC50=0,5 µM) Luteolin-4‘-O-glucosid (IC50=100 µM) und Quercetin-4‘-O-glucosid (IC50=170 µM) den hSGLT1 am stärksten. Vergleichbare Ergebnisse zeigten eigene Untersuchungen am rbSGLT1 mittels der SURFE2R-Technologie. Neben den oben genannten Substanzen hemmte Quercetin-7-O-glucosid den rbSGLT1 ebenfalls sehr gut. Flavonoidglucoside, die in Position 3 des Aglykons glucosyliert vorlagen, zeigten in beiden Systemen eine eher moderate Hemmwirkung. Inhibitions-unterschiede können u.a. auf die unterschiedlichen verwendeten SGLTs (human & rabbit) zurückgeführt werden. Bestimmte Kombinationen aus Phlorizin und Quercetin-4‘-O-glucosid zeigten im SURFE2R-System synergistische Inhibitionseffekte, was auf unterschiedliche Wirkmechanismen hinweist. Darüber hinaus zeigten Flavonoid-haltige Pflanzenextrakte wie z.B. Grünkohl-, Zwiebel- und Apfelextrakte gute bis sehr gute Hemmungen des hSGLT1 im Oozytenmodell. Ein Apfelextrakt wies mit einer IC50 von 2 µg/mL (≙ 0,32 µg Phlorizin) die stärkste Hemmung am hSGLT1 auf. Grünkohlextrakte wurden über eine Saftherstellung mit Hilfe Zellwand-degradierender Enzyme gewonnen, wobei 15-20% der im Ausgangsmaterial enthaltenen Flavonoide extrahiert werden konnten. Eine Erhöhung der Flavonoidausbeute im Saft konnte durch die Zugabe von Ethanol oder Detergentien nicht erreicht werden. Mittels eines Adsorberharzes konnte der Flavonoidgehalt, bezogen auf den Saft, um den Faktor 10 angereichert werden. Außerdem wurden 6 unterschiedliche Adsorberharze und unterschiedliche Elutions-methoden auf ihre Verwendbarkeit für die Anreicherung der polyphenolischen Inhaltsstoffe im Batch- und Säulenverfahren geprüft. Das Flavonoidmuster im pflanzlichen Ausgangsmaterial wurde mit Hilfe von HPLC-DAD und ESI-(-)-MS2 identifiziert und quantifiziert. Die selbständig etablierte Methode ermöglichte eine nahezu vollständige Auftrennung und Charakterisierung unterschiedlichster polyphenolischer Substanzen. Grünkohlextrakte offenbarten ein komplexes Flavonoidmuster, in dem über 40 teilweise acylierte Flavonoidderivate und über 10 Hydroxyzimtsäurederivate identifiziert werden konnten. Die Hauptflavonoide bildeten Quercetin-3-O-sinapoyl-Sophorotriosid-7-O-glucosid und Kaempferol-3-O-sinapoyl-Sophorosid-7-O-Sophorosid. Die Quantifizierung der komplexen Flavonoidglycoside im Grünkohl erfolgte über die Aglyka nach saurer Hydrolyse. Hierbei wurden 2 Hydrolyse-Methoden miteinander verglichen. Neben Kaempferol und Quercetin konnte auch Isorhamnetin als Aglykakomponente in Flavonoid-angereicherten Grünkohlextrakten detektiert werden. Verschiedene Grünkohlsorten und der Einfluss des Blanchierens auf den Flavonoidgehalt wurden ebenfalls untersucht. Bestimmte unbehandelte Sorten wiesen dabei Gesamtflavonoidgehalte von bis zu 3 000 ppm bezogen auf die Frischmasse auf. Ein Blanchierprozess bei 98°C für 3 min verminderte den Flavonoidgehalt um fast 40%. Apfel- und Zwiebelextrakte wiesen im Gegensatz zum Grünkohl ein einfacheres Flavonoidmuster auf mit Phlorizin bzw. Quercetin-4‘-O-glucosid als Hauptinhaltsstoffen. Der Phlorizingehalt in Schalen und Kerngehäusen von über 30 Apfelsorten wurde verglichen, wobei die höchsten Phlorizinmengen im Kerngehäuse von ‚Nathusius Taubenapfel‘ und in der Schale von ‚Kanada Renette‘ quantifiziert wurden. Flavonoidaglyka liegen nativ überwiegend β-glycosidisch mit unterschiedlichen Zucker-komponenten verknüpft vor. Die mögliche Absorption dieser sekundären Pflanzenstoffe im Darm ist wahrscheinlich von einer intestinalen Deglycosylierung abhängig. Lactase-Phlorizin-Hydrolase, eine darmständige β-Glycosidase, die apikal in der Bürstensaummembran lokalisiert ist, könnte für die Deglycosylierung mit verantwortlich sein. Die LPH besitzt zwei aktive Zentren, eines verantwortlich für die Hydrolyse der Lactose, das andere für die Hydrolyse von Glycosyl-N-acylsphingosinen und Phlorizin. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob die LPH Flavonoide spalten kann, die eine gute inhibitorische Aktivität gegenüber dem SGLT1 aufzeigen. Hierfür wurde humane LPH aus CHO-exprimierenden Zellen mit Hilfe monoklonaler LPH-Antikörper isoliert und mit über 20 Flavonoiden sowie 3 Flavonoid-haltigen Pflanzenextrakten inkubiert. Die Untersuchung der Hydrolyse der Flavonoidglycoside erfolgte per HPLC-DAD, während die Spaltung von Lactose zu Glucose und Galactose photometrisch bestimmt wurde. Flavonoidglycoside mit terminaler Rhamnose (Quercitrin, Rutin, Naringin) sowie Isoflavonoide (Genistin, Sophoricosid) wurden nicht hydrolysiert. Flavonoidglucoside, die in Position 3‘, 4‘, 3 oder 7 glycosyliert vorlagen, wurden von der LPH in unterschiedlichem Ausmaß gespalten (Kaempferol-3-O-glucosid, Quercetin-4‘-O-glucosid, Apigenin-7-O-glucosid, Luteolin-3’,7-O-diglucosid). Eine Spaltung der Hauptflavonoide in einem Zwiebel- und Apfelextrakt konnte ebenfalls aufgezeigt werden. 40% der Hauptkomponente eines Zwiebelextraktes (Quercetin-4‘-O-glucosid) wurde in 90 min von der LPH deglycosyliert, was ihre Bedeutung bei der Flavonoid-Metabolisierung zeigt. Die teils acylierten und hochglycosylierten Flavonoidderivate im Grünkohl wurden von der LPH kaum angegriffen. Inkubationsversuche mit einer isolierten Phlorizin-Hydrolase (PH), die keine Lactaseaktivität aufweist, zeigten, dass neben Phlorizin auch einige Flavonoide gespalten wurden. Flavonoide, die in Position 7 bzw. 3 im Grundgerüst glucosyliert sind, wurden aktiv durch die PH gespalten, während andere wie Quercetin- und Luteolin-4‘-O-glucosid nicht hydrolysiert wurden. Diese Ergebnisse weisen insgesamt auf eine mögliche Deglycosylierung potentieller SGLT1-Inhibitoren durch die LPH hin, was bei in vivo Studien berücksichtigt werden sollte. Erste Daten einer Humanstudie, durchgeführt von Projektpartnern, zeigten eine Reduktion der postprandialen Plasma-Glucosespiegel nach Einnahme eines Apfel/Grünkohl-Mischextraktes.

Every year 270 000 people only in Germany are diagnosed with Diabetes mellitus and the majority of patients (90%) suffering from diabetes-mellitus type-2. The main objective of the project: ‘glucose transporters SGLTs: key molecule in prevention of diabetes mellitus?’, financially supported by the federal ministry of education and research, was to investigate the inhibitory activity of flavonoids on the sodium-dependent glucose-cotransporter 1 (SGLT1), responsible for intestinal glucose absorption. Sodium-dependent glucose-cotransporters (SGLTs) are predominantly found in the brush border membrane of the small intestine (SGLT1) and the proximal tubule of the nephron in the kidney (SGLT2). The current focus of diabetes research is the development of selective inhibitors of SGLT2 - responsible for glucose reabsorption from the primary urine. Phlorizin, a flavonoid belonging to the subgroup of dihydrochalcones, is known to inhibit both, SGLT1 and SGLT2. Phlorizin was lead compound for the development of SGLT-inhibitors. The search for SGLT1-inhibitors to reduce intestinal uptake of glucose could be another effective strategy to decrease blood glucose levels. By reducing the intestinal uptake of glucose in prediabetic patients, increased postprandial blood glucose concentrations might be avoided. An advantage would be that SGLT1-inhibitors could act without the necessity of being absorbed. In the course of a screening for other SGLT1 inhibiting flavonoids more than 50 flavonoids and some flavonoid containing plant extracts were tested with different in vitro and in vivo test-systems. In hSGLT1 expressing oocytes, using the two-electrode-voltage-clamp technology, phlorizin, luteolin-4’-O-glucoside and quercetin-4’-O-glucoside showed strongest inhibitory activity with IC50 values of 0.5 µM; 100 µM and 170 µM, respectively (results achieved by partners). Comparable results were obtained by own measurements using the SURFE2R-technology. In rbSGLT1 expressing CHO-cells quercetin-7-O-glucoside in addition showed good inhibitory effects. Flavonoids which were glycosylated in position 3 of the aglycone showed moderate inhibition in both systems. Differences between inhibition results in both systems most likely are caused by the use of different SGLTs (human & rabbit). Specific combinations of phlorizin and quercetin-4’-O-glucoside exhibited synergistic inhibitory effects in the SURFE2R-system indicating different mechanisms of inhibition. Furthermore flavonoid containing plant extracts, e.g. extracts of curly kale, onion and apple, showed good inhibitory activity against hSGLT1. An apple extract achieved the strongest inhibition with an IC50 of 2 µg/mL (≙ 0.32 µg phlorizin). In order to produce an extract of curly kale with high flavonoid content, an aqueous juice was prepared with the help of cell wall-degrading enzymes. The total flavonoid yield usually was 15-20% referring to the starting material. Neither the use of ethanol nor of solubilizers could increase the content of flavonoids in the juice. But flavonoids could be enriched by factor 10 using an adsorber resin. The development of an HPLC separation method with DAD and ESI-(-)-MS2 detection allowed the identification and quantification of individual flavonoids. The composition of flavonoid enriched extracts of curly kale exhibited a very complex pattern of flavonoids. Approximately 10 different hydroxycinnamic acid derivatives and about 40 highly glycosylated and additionally acylated kaempferol and quercetin derivatives could be identified and quantified. Main flavonoid derivatives could be shown to be quercetin-3-O-sinapoyl-sophorotrioside-7-O-glucoside and kaempferol-3-O-sinapoyl-sophoroside-7-O-sophoroside. The quantification of flavonoids in curly kale was done after hydrolyzing them into their aglyca. Two different hydrolyses were compared. Besides kaempferol and quercetin also isorhamnetin could be identified as aglycone in flavonoid enriched extracts of curly kale. Different varieties of curly kale showed total flavonoid contents up to 3 000 ppm/fresh weight. Blanching at 98°C for 3 min caused a loss of 40% of flavonoids. Furthermore the flavonoid compositions of extracts of apple and onion were characterized revealing a less complex flavonoid pattern in comparison to curly kale with phlorizin and quercetin-4’-O-glucoside as main components. The content of phlorizin was compared in the peel and the apple core of different apple varieties. The highest content of phlorizin was found in the apple-core of ‚Nathusius Taubenapfel‘ and in the peel of ‚Kanada Renette‘. Flavonoids naturally occur mainly as β-glycosides in plant-based food and herbal medicinal products. Bioavailability of flavonoids may depend on their intestinal hydrolysis before absorption and delivery to systemic circulation. Lactase-phlorizin-hydrolase (LPH), a β-glucosidase present at the apical side of the intestinal brush border membrane, might be one of the flavonoid hydrolyzing enzymes. LPH has two catalytic sites, one being responsible for hydrolysis of lactose, whereas the other exhibits activity against substrates like glycosyl-N-acylsphingosines and phlorizin. The ability of purified human LPH to hydrolyze various flavonoid glycosides was investigated in order to determine their metabolic stability as putative inhibitors of SGLT1. Human LPH was isolated from stably transfected CHO-cells by immunoprecipitation with monoclonal LPH antibodies. Specific activity measurements with known substrates, individual flavonoids and flavonoid containing plant extracts were performed. Deglycosylation of about 20 flavonoidglycosides was tested by HPLC-DAD. Hydrolysis of lactose into glucose and galactose was determined by a photometric method. Flavonoidglycosides with a terminal rhamnose residue (e.g. rutin, naringin and quercitrin) and isoflavone glycosides (e.g. sophoricosid and genistin) were not hydrolyzed by human LPH. A cleavage of flavonoid-mono-/di-β-glycosides with glucose residues in different positions (3, 4’, 3’, 7) of the aglycone could be observed (e.g. kaempferol-3-O-glucoside, quercetin-4’-O-glucoside, apigenin-7-O-glucoside and luteolin-3’,7-O-diglucoside). Hydrolysis of specific flavonoids could also be shown for a plant extract of onion and apple. On the one hand about 40% of quercetin-4’-O-glucoside, the main component of an onion extract, was deglycosylated by LPH, demonstrating its importance in the metabolism of flavonoids. On the other hand acylated flavonoidglycosides of curly kale were hardly hydrolyzed by LPH. Incubation with purified phlorizin-hydrolase (PH), which is not able to cleave lactose, showed deglycosylation of phlorizin and flavonoids being glycosylated in position 7 or 3 of the aglycone. Quercetin- and luteolin-4’-O-glucoside were not deglycosylated by PH. These results show that LPH is able to hydrolyze various flavonoids to different extents, showing good inhibitory effects on SGLT1. This has to be considered in in vivo studies. New in vivo data of project partners showed decreasing blood glucose levels in humans after ingesting bread in combination with a mixture of a flavonoid enriched extract of apple and curly kale.  

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Schwanck, Bettina: Flavonoide als potentielle Inhibitoren des darmständigen Natrium-abhängigen Glucose-Cotransporters 1 (SGLT1). 2012.

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