Proteomische Analyse der Zellmembran humaner Erythrozyten als Wirtszellen des Malariaerregers Plasmodium falciparum (WELCH 1897)

Philipp, Stephan

In der vorliegenden Arbeit wurde eine Methodik zur Anreicherung und Isolierung der Wirtszellmembran von P. falciparum-infizierten Erythrozyten erarbeitet. Die Proteine dieser Membranfraktion wurden mittels optimierter 2D 16-BAC/SDS PAGE und 2D CTAB/SDS PAGE, sowie mittels 2D IEF/SDS PAGE aufgetrennt und anschließend durch MALDI TOF/TOF identifiziert. Dabei wurde gezeigt, dass die kationische 2D PAGE gegenüber der 2D IEF/SDS PAGE signifikante Vorteile bei der Auftrennung von Membranproteinen und Membran-assoziierten Proteinen dieser Fraktion besitzt. Außerdem wiesen die Gele der kationischen PAGE eine recht hohe Reproduzierbarkeit auf. Die anschließende massenspektrometrische Analyse ergab, dass beide PAGEs sich gegenseitig ergänzten und für einige der identifizierten Proteine eine Interaktion mit dem Zytoskelett oder der Membran der Wirtszelle postuliert werden kann. Darunter befanden sich auch Proteine der Rhoptrien und den Maurer´s clefts, sowie Proteine deren Funktion sowie Lokalisation bisher unbekannt sind. Aus diesen Daten wurde ein hypothetisches Modell der identifizierten Proteine von spät-infizierten Erythrozyten aufgestellt. Zum Vergleich wurden die Proteine der Membranfraktion in einer 1D SDS PAGE aufgetrennt, mittels LC-MALDI TOF/TOF analysiert und eine umfangreiche Liste mit proteomischen Daten erstellt. Dabei wurden 733 plasmodiale Proteine identifiziert, von denen 45 % als exportierte Proteine, Membranproteine oder Proteinen unbekannter Funktion bzw. Lokalisation zugeordnet wurden, was für eine adäquate Anreicherung exportierter und mutmaßlich exportierter Proteine durch die angewandte Methodik spricht. Das Verfahren der gelbasierten, kationischen PAGE wurde neben den Wirtszellproteinen später Stadien auch für diejenigen Proteine verwandt, die aus der Wirtszelle früh-infizierter Erythrozyten stammen. Für die Anreicherung von Erythrozyten, die mit viablen frühen Stadien von P. falciparum infiziert sind, wurde eine auf Durchflusszytometrie basierende Methode entwickelt. Hierdurch wurde eine Anreicherung von mehr als 98 % erreicht. Bisher war es nicht möglich, eine solche Reinheit früher, lebensfähiger Parasitenstadien zu erreichen. Damit legt die hier erarbeitete Methode den Grundstein, um nun auch auf molekularer und proteomischer Ebene die verschiedenen Parasitenstadien miteinander quantitativ zu vergleichen. Danach wurde, analog zu den spät-infizierten Erythrozyten, die Wirtszellmembran angereichert und die Proteine extrahiert. Bei der 2D CTAB/SDS PAGE wurden drei plasmodiale Proteine gefunden, welche möglicherweise direkt nach der Invasion in die Wirtszelle vom Parasiten exportiert bzw. sezerniert wurden, um dort das Überleben des Parasiten sowie dessen Entwicklung innerhalb des Erythrozyten zu gewährleisten. Der Vergleich der 2D Gele von spät-infizierten Erythrozyten mit dem 2D Gel der früh-infizierten Erythrozyten ergab deutliche Unterschiede im Proteinbesatz der Membranfraktionen der unterschiedlichen Stadien. Dies zeigt die Notwendigkeit der stadienspezifischen Analyse des Parasiten und seiner Wirtszelle, um ein besseres Verständnis auf molekularer Ebene der von Seiten des Parasiten eingeleiteten Wirtszell-Modifikationen innerhalb des intraerythrozytären Entwicklungszyklus zu erlangen. Die Daten der vorliegenden Arbeit liefern erste Hinweise auf die Lokalisation verschiedener Proteine des Parasiten innerhalb der Wirtszelle, deren Funktion und Lokalisation bisher unzureichend aufgeklärt sind. Die Untersuchung dieser Proteine könnte wichtige Vorgänge bei der Modifikation der Wirtszelle im intraerythrozytären Entwicklungszyklus aufklären und so zu einem besseren Verständnis über die molekularen Interaktionen des Parasiten mit seiner Wirtszelle führen.

In the present work, a method for the isolation and purification of the host cell membrane of P. falciparum-infected erythrocytes was established. From the membrane fraction, proteins were extracted and separated by optimized 2D 16-BAC/SDS PAGE or 2D CTAB/SDS PAGE. Subsequently, the proteins were analyzed by MALDI TOF/TOF and the data were compared to gels from classical 2D IEF/SDS PAGE. It is shown that the gels from the cationic 2D PAGEs are highly reproducible and superior in separating membrane as well as membrane-associated proteins than the classical 2D IEF/SDS PAGE approach. In gels of the cationic PAGEs, several proteins were identified that might interact with the cytoskeleton or with the membrane of the host cell. Some of these proteins belong to the rhoptries and the maurer`s clefts of the parasite or represent proteins that are still uncharacterized. In an additional 1D SDS PAGE, combined with LC-MALDI TOF/TOF, 733 parasite-derived proteins were identified. From these, 45 % are annotated as exported proteins, membrane proteins or uncharacterized proteins, which show the effectiveness of the applied method. By use of fluorescence-activated cell sorting, a method for the enrichment of early-infected erythrocytes was established. Using this method, an enrichment of up to 98 % was achieved, and the parasites within the sorted erythrocytes remained viable. The host cell membrane was then isolated according to the protocol established for late stage-infected erythrocytes. Three plasmodial proteins were found in the gel of a first 2D CTAB/SDS PAGE. These proteins are probably exported to the host cell directly after invasion to assure the survival and development of the parasite within its host cell. The comparison of gels from different stages of the parasite clearly showed significant differences in the protein repertoire, which shows the need for stage-specific analysis of the parasite to better understand parasite induced host-cell mofifications. In conclusion, the data of this work form the basis for further analyses of yet uncharacterized proteins identified in the gels of early-infected as well as late-infected erythrocytes. The characterization of these proteins may contribute to better understand the modification of the host cell and the interaction between the parasite and the host cell at the molecular level.

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Philipp, Stephan: Proteomische Analyse der Zellmembran humaner Erythrozyten als Wirtszellen des Malariaerregers Plasmodium falciparum (WELCH 1897).

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