Isolierung und Charakterisierung von Bakterien aus Meeressedimenten und ihr Potential zur Produktion von antimikrobiellen Peptiden und Polyketiden

Kleinschmidt, Katrin

Die Suche nach neuen Wirkstoffen ist in der heutigen Zeit aufgrund vermehrter Resis-tenzbildung gegen bekannte Antibiotika wichtiger denn je. Marine Mi¬kro¬or¬ga¬nis¬men rücken dabei als Quelle neuer Wirkstoffe immer mehr in den Fokus. Diese Arbeit zeigt das aussichtsreiche Potential von marinen Sediment-assoziierten Bakterien zur Wirk-stoffproduktion. Indem diese Bakterien aus verschiedenen, zum Teil vorher noch nicht untersuchten Standorten isoliert und kultiviert wurden, konnte ein großer Pool an poten-tiellen Kandidaten zur Wirkstoffproduktion geschaffen werden. Mit molekularbiologi-sche Methoden, wie einem PCR-basiertem Screening mit spezifischen Primern für nicht-ribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) und Polyketidsynthasen (PKS), sowie bio-logische Aktivitätstests mit ausgewählten Testorganismen konnte die Auswahl an Stämmen für weitere Arbeiten schnell und effizient eingegrenzt werden. Ausgewählte Isolate wurden chemischen und chromatographischen Analysen unterzogen um ihre Sekundärmetabolite zu identifizieren. Von den in dieser Arbeit untersuchten Bakterien enthielten über 50 % mindestens ein Sekundärmetabolit-Gencluster einer nicht-ribosomalen Peptidsynthetase oder Po-lyketidsynthase und/oder wiesen antimikrobielle Aktivität gegen die Testorganismen auf. Insbesondere traf dies auf die Gram-positiven Bakterien der Gattungen Actinobac-teria und Firmicutes zu.; aus diesen beiden Phyla wurden Stämme zur detaillierten Be-arbeitung ausgesucht. Ausgewählt wurden Vertreter von Bacillus amyloliquefaciens aus unterschiedlichen Sedimenten aufgrund ihrer Aktivitätsspektren und vorhandenen Sekundärmetabolit-Gencluster. Alle B. amyloliquefaciens Isolate inhibierten moderat bis stark mindestens zwei Tesorganismen. Neun (von zehn) Isolate wiesen NRPS und/oder PKS Gencluster auf. Wie ein Vergleich der Metabolitspektren zeigte, produzierten diese Stämme ver-schiedene anti¬mikro¬biell wirksame nicht-ribosomale Lipopeptide (Substanzklassen der Surfactine, Iturine und Fengycine) sowie zwölf bislang nicht identifizierte Substanzen. Welche Substanzklasse der nicht-ribosomalen Lipopeptide produziert wurden war zum Teil stammspezifisch und herkunftsunabhängig. Der Vergleich zeigt, dass es sich auch lohnt in Stämmen, die auf der 16S rDNA Ebene eine hohe Similarität (≥99,5 %) haben nach neuen Metaboliten zu suchen. Als weiteres Isolat wurde gtP20b (Bacillus sp.) ausgewählt. Der Rohextrakt von diesem Stamm inhibierte moderat bis stark die Testorganismen Xanthomonas campestris und Candida glabrata und zeigte im PCR-basierten Screening Gencluster für nicht-ribosomale Peptidsynthetasen. Durch die Kultivierung von gtP20b in vier verschiedenen Medien wurden acht bekannte nicht-ribosomale Lipopetide (Substanzklasse der Iturine, Surfactine und Fengycine), als auch sechs unbekannte Sekundärmetabolite detektiert. Das Genom dieses Stammes wurde komplett sequenziert um auch auf genetischer Ebene einen Einblick in das Potential zur Wirkstoffproduktion zu erhalten und die im Labor produzierten Metabolite mit den auf dem Genom enthaltenen Genclustern zu verglei-chen. Für alle produzierten nicht-ribosomalen Lipopeptide konnten passende Gencluster identifiziert werden. Zusätzlich wurden bisher unbekannte Polyketidsynthase-Gencluster gefunden, deren Produkte noch identifiziert werden müssen. Neben dem Bacillus-Isolat (gtP20b) zeigte auch ein Streptomyces-Isolat (C42) Hinweise auf eine vielversprechende Wirkstoffproduktion. Sekundärmetabolit-Gencluster von NRPS und PKS I konnten nachgewiesen werden, ebenso wie eine Inhibierung des Test-organismus Candida glabrata. In der chemischen und chromatographischen Auswertung der Metabolite konnte die Produktion von zwei bekannten Sphingolipiden und zwei unbekannten Peptiden gezeigt werden. Mit Hilfe von HPLC/ELSD und GC/MS Analysen wurde die Amino¬säure¬n und Konfigurationen des Peptides m/z 898,9 ermit-telt. Von den acht enthaltenen Aminosäuren liegen fünf in der D-Konfiguration vor. Der Einbau von Aminosäuren in der D-Konfiguration in Mikroorganismen ist bislang nur über spezielle NRPS-Domänen bekannt. Dieses unbekannte Peptid wird damit über eine nicht-ribosomale Peptidsynthetase synthetisiert. Bislang konnten, aufgrund des hohen GC-Gehaltes nur 60 % des Genoms sequenziert werden. Aber bereits auf diesem Teil wurden neun bekannte NRPS und PKS Gencluster sowie einige unbekannte Sekundär-metabolit-Gencluster identifiziert. Die genaue Anzahl unbekannter Gencluster kann erst festgestellt werden, wenn das Genom vollständig sequenziert, assembliert und annotiert ist. Dieser Stamm scheint jedoch eine vielversprechende Quelle für weitere neue Wirk-stoffe zu sein. Wie diese Arbeit zeigt, kann dass Potential von Bakterien zur Wirkstoffproduktion durch die Kombination mikrobiologischer und molekularbiolischer Methoden gut erfasst werden. Im ersten Schritt werden Bakterien aus marinen Sedimenten isoliert und kultiviert. Um dann im zweiten Schritt Metabolite chemisch zu analysieren und ausge-suchte Genome zu sequenzieren. Neue Bakterien-Isolate aus marinen Sedimenten zeigen stammspezifische Unterschiede in der Metabolitproduktion und wiesen so bereits bekannte Bakterien-Taxa als vielversprechende Wirkstoffproduzenten aus.

As microbial resistence against known antibiotics increases, the search for new chemical structures becomes more important. Especially marine bacteria are of particular research interest as natural product producer. To further asses the potential marine bacteria from different sediments were isolated, cultivated and analyzed with chemical and biomolecular methods. To bypass the limitations of existing methods for natural product discovery the search for alternative strategies e.g. genome-based strategies, is necessary. For example PCR-based screening with special primers is a fast and efficient possibility to assess the potential of a species to produce natural products. It can therefore be used to select isolates for further tests. Over 50% of the investigated isolates (especially Actinobacteria and Firmicutes) con-tained gene clusters for non-ribosomal peptidsynthetases (NRPS) or polyketidsynthases (PKS) and/or show antimicrobial activity against some test organisms. Of these isolates the representatives of Bacillus amyloliqufaciens were chosen and their natural product pro¬duction was compared to each other. The investigation of equal taxa from different habitats is not common. Nine (out of ten) Bacillus amyloliquefaciens isolates had sec-ondary metabolite gene clusters and showed differences in the production of natural products. A location-independent production of different antimicrobial non-ribosomal lipopeptides (substance classes of surfactin, iturin and fengycin) and twelve unknown substances could be shown. This demonstrates that bacteria of the same taxon (16sRNA similarity ≥99,5 %) are a viable source for the search of new substances. Especially the taxa Bacillus and Streptomyces are known as good natural product pro-ducer. Two isolates were chosen (gtP20b Bacillus sp. and C42 Streptomyces sp.) and the metabolites and genomes were analyzed. The crude extract from isolate gtP20b in-hibited the test organisms Xanthomonas campestris and Candida glabrata and it could detected gene clusters for NRPS with PCR. It produces non-ribosomal lipopeptides (substance classes iturine, surfactine and fengycine) as well as six unknown substances in culture. The genome sequencing revealed known NRPS gene clusters as well as un-known gene clusters for PKS and NRPS/PKS hybrid. The detected lipopeptides of iso-late gtP20b were assigned to annotated NRPS gene clusters. The other putative gene cluster of PKS and hybridsystems contain a potential for novel natural products. The identification of these unknown gene cluster is still in progress. The isolate C42 (Streptomyces sp.) was selected due to inhibiting to Candida glabrata and NRPS and PKS gene clusters detected during PCR. Two sphingolipids and two new un¬known non-ribosomal peptides were identified with chemical and chromatographic methods. With HPLS/MS and GC/MS the identity and configuration of the eight amino acids of peptide m/z 898.9 was detected. The peptid m/z 898.9 contain s D-alanin, D-phenylalanin, L-valin, D-valin, D-leucin, L- (allo) isoleucin and D- (allo) isoleucin. Amino acids with the D-configuration can only be incorporated into peptides with specially NRPS domains. This proves that the new peptide m/z 898.9 is synthesized with non-ribosomal synthetases. Approximately 60 % of the genome from C42 have been sequenced. The genome included a number of known and unknown NRPS and PKS gene cluster with putative products that could not be produced in the lab. This work shows that the combination of cultivation and genome-based methods allows to take advantages of biosynthetic potential of marine bacteria. New isolates of known bacteria taxa from marine sediments show strain specific distinctions in the natural product production and are good producers for natural products.

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Kleinschmidt, Katrin: Isolierung und Charakterisierung von Bakterien aus Meeressedimenten und ihr Potential zur Produktion von antimikrobiellen Peptiden und Polyketiden.

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