Pelargonium sidoides DC: Vermehrung mittels somatischer Embryogenese sowie Charakterisierung von biologisch aktiven Arabinogalaktan-Proteinen

Duchow, Stefanie

Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmalig Arabinogalaktan-Proteine (AGPs) in der Familie der Geraniaceae - speziell von der Art Pelargonium sidoides - nachgewiesen, isoliert und charakterisiert. Dabei dienten getrocknete und frische Wurzeln sowie etablierte Zellkulturen, die ein optimales Wachstum in MS-Medium mit 1 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 0,2 mg/l Kinetin und je 50 mg/l Ascorbin- und Citronensäure zeigten, als Ausgangsmaterial. Die Isolierung von reinem AGP aus dem Wurzelmaterial erwies sich als schwierig, da die Glykoproteine mit den in der Pelargonium-Wurzel vorkommenden Proanthocyanidinen und hydrolysierbaren Gerbstoffen sowie der Stärke vermutlich nicht-kovalente Interaktionen ausbildeten. Im Gegensatz dazu war die Isolierung von reinen AGPs sowohl aus Kalluskulturen als auch aus den Zellen und dem Kulturmedium von Suspensionskulturen erfolgreich. Im Rahmen ihrer Charakterisierung konnte der 10% große Proteinanteil mit einer für klassische AGPs annähernd typischen Aminosäurezusammensetzung mit hohen Mengen an Ala (12%), Ser (11%), Asx (11%) und Thr (8%), sowie relativ niedrigen Anteilen von Pro (3%) und Hyp (4%) detektiert werden. Den Hauptteil des AGPs macht das Polysaccharid aus, welches ein stark verzweigtes Arabinogalaktan (AG) des Typ-II darstellt. Dabei bildet eine β-1,3-glykosidisch verknüpfte Galaktosekette das Rückgrat des AGs, welches über 1,3,6-Galp-Verzweigungspunkte mit 1,6-Gal-Seitenketten verbunden ist, die ihrerseits 1,2- und 1,5-verknüpfte furanosidische Arabinosen tragen. Mit ca. 28% bilden die terminalen Arabinosen neben 6-7% terminaler Glukuronsäure und ca. 4% terminaler Galaktose die dominierenden Endgruppen des Moleküls. Neben diesen stark verzweigten Arabinogalaktaneinheiten, die unterschiedliche Größen aufweisen, lassen sich auch kleine Oligosaccharide aus Arabinose finden. Die Zucker sind vor allem über O-glykosidische Bindungen via Hyp und eventuell auch via Ser und Thr mit dem Proteinteil verknüpft und bilden ein 90 kDa großes AGP. Neben der analytischen Charakterisierung wurden verschiedene biologische Aktivitäten der AGPs sowohl auf den menschlichen Organismus als auch auf die pflanzlichen Gewebe und ihre Entwicklung getestet. Im Gegensatz zu AGPs aus Echinacea purpurea konnte keine signifikante Inhibition oder Aktivierung des humanen Komplementsystems über die drei verschiedenen möglichen Wege (klassisch, alternativ und Lektin-abhängig) durch aufgereinigtes Pelargonium-Zellkultur-AGP ermittelt werden. Anhand von Suspensionskulturen wurde nachgewiesen, dass die Blockade von AGPs durch Zugabe von Yariv-Reagenz zum programmierten Zelltod (PCD) der behandelten Zellen führt. In speziell angefertigten Nasenkolben zeigten mit β-Glc-Yariv-Reagenz behandelte Zellkulturen von P. sidoides nicht nur eine konzentrations- und zeitabhängige Wachstumsinhibition, sondern auch die typischen morphologischen Veränderungen von Zellen, die dem PCD unterliegen, wie z.B. das Schrumpfen des Zytoplasmas. Des Weiteren konnte erfolgreich die beim PCD mittels Endonukleasen entstehenden DNA-Bruchstücke isoliert, gelelektrophoretisch aufgetrennt und als DNA-Ladder detektiert werden. Daneben wurde der Einfluss der AGPs auf die somatische Embryogenese bzw. in der Induktion der Embryonen an dem erstmals für P. sidoides etablierten Vermehrungsverfahren nachgewiesen.

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Duchow, Stefanie: Pelargonium sidoides DC: Vermehrung mittels somatischer Embryogenese sowie Charakterisierung von biologisch aktiven Arabinogalaktan-Proteinen.

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