Optimierung der zellfreien Proteinsynthese durch Etablierung einer schnellen in-situ Faltungskontrolle mittels GFP-Fusion

Müller-Lucks, Annika

Im Rahmen dieser Arbeit wurde das DdAqpB aus D. discoideum untersucht. Zu diesem Zweck wurde Membranproteinfraktion aus D. discoideum gewonnen und das DdAqpB mittels Western Blot nachgewiesen. Dieser ließ die Vermutung zu, dass das DdAqpB in vivo in glykosylierter Form vorliegen könnte, was durch eine chemische Deglykosylierung bestätigt wurde. Desweiteren wurde DdAqpB zellfrei hergestellt. Dafür wurde zunächst das zellfreie Proteinsynthese-System etabliert, sowie S30-E. coli-Extrakt und T7-RNA-Polymerase hergestellt. Wurde das DdAqpB ohne weitere Zusätze zellfrei produziert, trat eine Zersetzung des Proteins ein. Durch Zusatz von Detergenzien konnte dies vermieden werden. Anschließend wurde für das DdAqpB eine mögliche Faltungskontrolle durch C-terminale Fusion von GFP erstellt. Diese lieferte in der zellfreien Synthese zwar Proteinprodukt, jedoch war keine Fluoreszenz sichtbar. Der Versuch wurde mit dem PfAQP aus P. falciparum wiederholt. Hier zeigte sich, dass Gesamtproteinmenge und Stärke der Fluoreszenz nicht zwangsläufig korrelieren müssen und zudem beide je nach Detergens-Zusatz stark variieren können. Entsprechend wurden Sekundärstrukturanalysen von in verschiedenen Detergenzien hergestelltem PfAQP mittels Zirkulardichroismus durchgeführt, die einen Einfluss der Reaktionszusätze auf die Faltung deutlich machten. Nachdem gezeigt werden konnte, dass die Produktionsparameter des Fusionsproteins auf das nicht fusionierte Protein übertragen werden können, wurde PfAQP präparativ hergestellt und dessen Funktionalität nachgewiesen. Da eine schnelle Messung des Reaktionsansatzes im Fluorimeter möglich war, wurden weitere GFP-Fusionsproteine zellfrei hergestellt: Die pflanzlichen Equilibrativen Nukleosid-Transporter AtENT 1 und 3, der menschliche Harnstoff-Transporter hUT-B und der menschliche Monocarboxylat- Transporter hMCT4. Nur bei dem hMCT4 war in keinem Reaktionsansatz Fluoreszenz detektierbar. Zusätzlich konnte das menschliche AQP3 zellfrei hergestellt und dessen Wasserleitfähigkeit nachgewiesen werden.

When DdAqpB was detected in the membrane protein fraction of D. discoideum by Western blotting, it was hypothesized that the protein might be glycosylated in vivo. To support this assumption a chemical deglycosylation was carried out. DdAqpB was also produced cell free. For this purpose the cell free protein synthesis technique was established, as well as T7-RNA-polymerase and S30-E. coli-extract were produced. However, cell free production of the DdAqpB lead to the destruction of the protein when no solubilizing detergents were added. In the following step, a possible folding control for the DdAqpB was constructed by c-terminal fusion of GFP to the protein. The DdAqpB-GFP fusion protein was then produced in the cell free system. As a result, protein was produced, but no fluorescence was detectable. The experiment was repeated with the PfAQP from P. falciparum and evidence was provided that total protein yield and fluorescence intensity do not necessarily show a correlation. Besides, both of them were strongly dependent on the detergent added. Accordingly, secondary structure analyses using circular dichroism were carried out on PfAQP that was produced in different detergents. It was proven that reaction mixture components can have an impact on the protein folding. After demonstration of transferability of the production parameters of the GFP-fusion to the unfused protein, PfAQP was produced in preparative scale, and functionality was shown. As high throughput measurements in the fluorometer were possible, more GFP-fusion proteins were produced in the cell free system: The plant equilibrative nucleoside transporters AtENT 1 and 3, as well as the human urea transporter hUT-B and the human monocarboxylate transpoter hMCT4. Only hMCT4 exhibited no fluorescence in all reactions. Apart from that, the human AQP3 was produced cell free, and its water permeability was confirmed.

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Müller-Lucks, Annika: Optimierung der zellfreien Proteinsynthese durch Etablierung einer schnellen in-situ Faltungskontrolle mittels GFP-Fusion. 2012.

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