Recombinant Expression of the NOD2 CARD2 Domain and Determination of the Solution Structure of Equine Alpha-Defensin 1 (DEFA1)

Shomali, Mohammad Rasool

Nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2 (NOD2) is a cytosolic pattern recognition receptor (PRR). It binds muramyl dipeptide and consists of two N-terminal caspase-activating and recruitment domains (CARD) (CARD1 and CARD2), one central nucleotide-binding oligomerization domain (NOD) and C-terminal leucin rich repeats (LRR). The CARD2 domain of NOD2 (NOD2 CARD2) is a member of death domain superfamily, which is characterized by holding six antiparallel alpha-helixes. NOD2 CARD2 is involved in signaling of NOD2. Recently it was shown that NOD2 CARDs (CARD2 and CARD2) are involved in the oligomerization of NOD2 in vitro, however the precise function of CARD2 domain in NOD2 is still unclear. In the first part of this thesis a protocol for expression, purification and refolding was established to be the basis for tertiary structure determination and in vitro functional investigations. The second part of the thesis deals with determination of tertiary structure of equine alpha-defensin 1. The peptide shows high killing activity against Gram‐positive, Gram‐negative bacteria and fungus and it is a potential antibiotic peptide against R. equi and S. zooepidemicus. To elucidate the mechanism of action of equine alpha-defensin 1 the solution structure was determined by two‐dimensional homonuclear NMR‐spectroscopy. The synthetic peptide was refolding, purified and NMR spectra of the purified peptide were recorded. The tertiary structure contains a cysteine‐stabilized β‐strands motif and shows a high structural homology to other alpha‐defensins. Compared to the surface potential of human defensins, DEFA1 displays an unusual distribution of the charges. The similarity between DEFA1 and hydramacin-1 in charges distribution and inducement of aggregation in treated bacterial cells and liposomes supports the hypothesis that the mode of action of DEFA1 is similar to the mode of action of hydamacin-1.

Nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2 (NOD2) ist ein intrazellulärer PRR (pattern recognition receptor). Dieser Rezeptor bindet Muramyldipeptid und besteht aus zwei N-terminalen caspase-activating and recruitment domains (CARD1 und CARD2), einer zentralen nucleotide-binding oligomerization domain (NOD) und einer C-terminalen leucin rich repeats (LRR). Die CARD2 Domäne von NOD2 (NOD2-CARD2) ist ein Mitglied der Todesdomäne Superfamilie (death domain superfamily), die durch sechs antiparallele alpha-Helices gekennzeichnet ist. Die NOD2-CARD2 ist an der Weiterleitung der Signal von NOD2 beteiligt. Kürzlich wurde gezeigt, dass die CARD-Domaänen von NOD2 (CARD1 und CARD2) auch an der Oligomerisierung von NOD2 in vitro beteiligt sind, die genaue Funktion der CARD2-Domäne in NOD2 ist jedoch bis jetzt unklar. Im ersten Teil dieser vorliegenden Arbeit wurde ein Protokoll für die Expression, Reinigung und Rückfaltung etabliert, um die Basis für Tertiärstrukturaufklärung und in vitro funktionelle Untersuchungen von der NOD2-CARD2 Domäne zu schaffen. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit behandelt die Tertiärstruktur des Equine Alpha-Defensins 1 (DEFA1). Das Peptid verfügt über eine hohe antimikrobielle Aktivität gegen Gram-positiven und Gram-negativen Bakterian sowie gegen Pilze. Um den Wirkmechanismus des Peptids näher zu bestimmen, sollte die Tertiärstruktur des DEFA1-Peptides mittels zweidimensionaler homonuklearer (2D-1H) NMR‐Spektroskopie aufgeklärt werden. Zu diesem Zweck wurde ein Renaturierung- und Reinigungsprotokoll für DEFA1 etabliert. Von dem gereinigten und renaturierten Peptid wurden 2D-1H‐NMR‐Spektren aufgenommen. Die aufgeklärte Tertiärstruktur des DEFA1 entspricht einem durch Disulfidbrücken stabilisierten β‐Faltblattmotiv und weist eine hohe strukturelle Verwandtschaft zu den Alpha‐Defensinen auf. Im Vergleich zu Oberflächenpotentialen von humanen Alpha‐Defensinen zeichnet sich die Oberflächenpotential des DEFA1 durch eine ungewöhnlich Verteilung der Ladungen aus. Die Ähnlichkeit zwischen DEFA1 und Hydramycin-1 betzüglich der Oberflächenverteilung von Ladungen und Veranlassung der Aggregation in behandelten Bakterienzellen und Liposomen unterstützt die Hypothese, dass die Wirkungsweise der DEFA1 der Wirkungsweise von Hydamacin-1 ähnelt.

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Shomali, Mohammad: Recombinant Expression of the NOD2 CARD2 Domain and Determination of the Solution Structure of Equine Alpha-Defensin 1 (DEFA1). 2012.

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