Molecular Characterisation of Antimicrobial Arsenal of Dictyostelium discoideum

Dhakshinamoorthy, Ranjani

6.A Summary In Entamoeba histolytica, Amoebapores and lysozymes are known to confer antimicrobial functions. The structure and functions of Amoebapores and lysozymes are evolutionally conserved, as evidenced by their analogous in many other organisms. Amoebapores and its structural counterparts have five α-helices that are connected by disulfide bonds, involving cysteine residues. Any protein with this typical structure is categorised under the SAPLIP family (Saposin-like protein) and the domain is called SAPLIP domain. SAPLIPs are known for their diverse cellular functions. The Amoebapores (M Leippe 1997) from E. histolytica and their structural and functional analogues, NK-lysin (porcine) and granulysin (human) are known for their antimicrobial and cytolytic functions. By contrast, the name giving Saposins (human) are necessary for lipid metabolism. Dictyostelium discoideum, has a multi-protein complex in which one component, called countin has a SAPLIP domain. Countin is required for aggregate size determination during development. Earlier work in our laboratory has found that the D. discoideum genome harbours 17 genes, which encode for 33 putative Amoebapore-like peptides (Apls). In addition, the D. discoideum genome comprises 15 genes coding for four different classes of lysozymes. These classes are c-type lysozymes (LyC), phage-type lysozymes (LyT4), Entamoeba-type lysozymes (LyEh), and the amoeba lysozymes (Alys), which is a unique class of lysozymes found in D. discoideum. As D. discoideum amoebae feed on bacteria, they are at a risk to encounter pathogenic bacteria. Therefore, it has been postulated that the Apls and lysozymes may play a synergistic role to kill and degrade the bacteria. My study has focused on three apl genes (aplD, aplJ, and aplP) and two lysozyme genes (lyC2 and lyC3), based on collaborator reports that these genes are implicated in bacterial destruction. The phenotypic characterisations were carried out with the single gene KO mutants for the corresponding genes. All the gene disruptions were performed in wild type Ax2 background. Among all five KO mutants tested for growth on bacteria, the aplD¯ showed growth defects on several strains of K. pneumoniae. The aplP¯ and lyC2¯ were defective for growth only on the capsule defective mutant of Kp52145 (K¯). As the aplD¯ was defective for growth on different K. pneumoniae strains, further phenotypic characterisations were carried out for the aplD¯. In accordance with growth defects on K. pneumoniae, the aplD¯ was also defective for intracellular killing of K. pneumoniae (KpLM21). Moreover, the wild type Ax2 cells confronted with KpLM21 showed at least three fold up-regulation of the aplD transcript (qRT-PCR). Similar qRT-PCR experiments with axenic Ax2 revealed that the transcription of aplD is moderately up-regulated during axenic growth, whereas sturdily up-regulated during development and peaked at the slug stage. This spontaneous up-regulation of aplD transcript during Ax2 development, which was performed totally in the absence of bacteria, prompted me to do the slug infection experiments with the aplD¯. As the D. discoideum cells stop feeding at the onset of development they may need an armament to protect their developing structures from foreign intruders. In fact, the migrating slugs are highly prone to infection when compared with the other stages of development. Following this, the slug infection experiments were performed with a GFP expressing strain of K. pneumoniae (KpGFP) and an E. coli strain that expressed DsRed (E. coli DsRed). The Ax2 slugs were used as controls. Unlike Ax2 slugs, the aplD¯ slugs infected with KpGFP showed massive KpGFP accumulation which corroborates with growth and killing defects of aplD¯ with K. pneumoniae. In contrast, the aplD¯ slugs infected with E. coli DsRed were able to slough off E. coli DsRed in their slime trail. However, I could show that the aplD¯ slugs were unaffected in their ability to form S cells and to sequester toxin (EtBr). Apart from their reduced ability to defend against K. pneumoniae, the aplD¯ also showed several morphogenetic defects during development. This includes late stream breaks (12 h), delayed formation of smaller slugs (18 h) and fruiting bodies (~ 26 h), and a relatively reduced spore formation efficiency (sfe). Nevertheless, the spore morphology and spore viability were unaffected in aplD¯. These observations may point to an additional role for aplD during D. discoideum development. On the other hand, it is also possible that the aplD¯ is immunocompromised and therefore it is showing several developmental defects. In summary, this study shows that the aplD is crucial for the growth of D. discoideum on K. pneumoniae and also for the intracellular killing of K. pneumoniae. Additionally, aplD is required to prevent K. pneumoniae accumulation in the D. discoideum slugs.

6.B Zusammenfassung In Entamoeba histolytica sind die Amoebapores und die Lysozyme dafür bekannt, antimikrobielle Funktionen zu übernehmen. Die Struktur und die Funktion sowohl der Amoebapores als auch der Lysozyme sind evolutionär konserviert, was durch das Vorhandensein analoger Proteine in einer Vielzahl anderer Organismen bewiesen ist. Die Amoebapores und deren strukturelle Verwandte sind durch fünf α-Helices charakterisiert, die über Disulfidbrücken zwischen Cysteinresten miteinander verbunden sind. Jedes Protein, das diese typische Struktur zeigt, wird der SAPLIP-Familie (Saposin-like protein), den Saposin-ähnlichen Proteinen, zugeordnet. Die entsprechende Domäne wird demnach SAPLIP-Domäne genannt. Die SAPLIPs sind für ihre vielfältigen Funktionen bekannt. Die Amoebapores aus E. histolytica und deren strukturell und funktionell analoge Proteine, das NK-lysin aus dem Schwein und das Granulysin aus dem Menschen, sind für ihre antimikrobiellen und cytolytischen Funktionen bekannt. Die namengebenden Saposine des Menschen sind dagegen für den Lipidstoffwechsel wichtig. In Diyctyostelium discoideum gibt es eine Komponente eines Multi-Protein-Komplexes, das countin, das ebenfalls eine SAPLIP-Domäne besitzt. Countin ist notwendig für die Bestimmung der Aggregatgröße während der Entwicklungsphase von D. discoideum. Als Ergebnis einer früheren Arbeit in diesem Labor konnte gezeigt werden, dass das Genom von D. discoideum 17 Gene aufweist, die für 33 putative Amoebapore-ähnliche Peptide (Apls) codieren. Zudem finden sich im Genom von D. discoideum 15 Gene, die für Lysozyme aus vier verschiedenen Klassen codieren. Dabei handelt es sich um die Klassen der c-Typ Lysozyme (LyC), T4 Phagen-Lysozyme (LyT4), Lysozyme des Entamoeba-Typs (LyEh) und die Amoeba-Lysozyme (Alys), eine ausschließlich in D. discoideum vorkommende Lysozym-Klasse. Da das Amöbenstadium von D. discoideum Bakterien als Nahrungsquelle nutzt, besteht für diese auch ein hohes Risiko, auf pathogene Bakterien zu treffen. Daher wurde angenommen, dass die Apls und die Lysozyme eine synergistische Rolle beim Töten und Degradieren von Bakterien spielen könnten. In meiner Arbeit habe ich mich auf die Untersuchung von drei Apl-Genen (aplD, aplJ und aplP) sowie zwei Lysozym-Genen (lyC2 und lyC3) konzentriert, für die bereits von einer kooperierenden Arbeitsgruppe berichtet wurde, dass sie möglicherweise eine Rolle beim Abbau von Bakterien spielen. Die phänotypischen Charakterisierungen wurden mithilfe von Deletionsmutanten für die einzelnen Gene durchgeführt. Als Ausgangsstamm für die Herstellung dieser Mutanten wurde jeweils der Wildtyp-Stamm Ax2 verwendet. Alle fünf Deletionsmutanten wurden bezüglich ihrer Fähigkeit, auf Bakterien zu wachsen, untersucht. Dabei zeigte die aplD--Mutante Wachstumsdefekte auf den meisten der getesteten Stämme von Klebsiella pneumoniae, während die Mutanten aplP- und lyC2- nur einen Wachstumsdefekt auf dem Klebsiella-Stamm Kp52145 (K-) zeigten, der sich wiederum dadurch auszeichnet, dass er eine veränderte Kapsel aufweist. Da das Wachstum der aplD--Mutante auf verschiedenen Stämmen von K. pneumoniae gestört war, wurde diese Mutante im Folgenden genauer phänotypisch charakterisiert. In Übereinstimmung mit den Wachstumsdefekten auf K. pneumoniae zeigte sich, dass die aplD--Mutante zudem in ihrer Fähigkeit beeinträchtigt war, intrazelluläre K. pneumoniae (KpLM21) zu töten. Des Weiteren zeigten Zellen des Wildtyps Ax2, die mit KpLM21 konfrontiert wurden, eine mindestens dreifache Hochregulierung das aplD-Transkripts (qRT-PCR). Ähnliche qRT-PCR-Experimente mit axenischen Ax2-Zellen ergaben, dass die Transkription von aplD während des axenischen Wachstums nur leicht hochreguliert wird, wohingegen dies während der Entwicklungsphase sehr stark der Fall ist, mit einem Maximum im sogenannten Slug-Stadium. Die spontane Hochregulierung der aplD-Transkription während der Entwicklung von Ax2-Zellen passierte in der kompletten Abwesenheit von Bakterien. Diese Beobachtung veranlasste mich dazu, das Infektionsexperiment mit dem Slug-Stadium von aplD--Mutanten durchzuführen. Da D. discoideum Zellen mit dem Beginn der Entwicklungsphase aufhören zu fressen, ist es anzunehmen, dass sie Abwehrmoleküle benötigen, um ihre sich entwickelnden Strukturen vor fremden Eindringlingen zu schützen. Tatsächlich sind wandernde Slugs im Vergleich zu den anderen Stadien der Entwicklungsphase hoch anfällig für Infektionen. Daraufhin wurden Infektionsexperimente mit Slugs mit einem GFP exprimierenden Stamm von K. pneumoniae (KpGFP) und einem DsRed exprimierenden Stamm von E. coli (E. coli DsRed) durchgeführt. Slugs des Wildtyps Ax2 wurden dabei als Kontrolle verwendet. Anders als der Wildtyp wiesen die mit KpGFP infizierten aplD--Slugs eine massive Akkumulation der Bakterien auf, was mit den entsprechenden Wachstums- und Tötungsdefekten dieser Mutante übereinstimmt. Im Gegensatz dazu waren die mit E. coli DsRed infizierten aplD--Slugs in der Lage, diese Bakterien in ihre Schleimspur mit abzugeben. Zudem konnte ich zeigen, dass die aplD--Slugs nicht in ihrer Fähigkeit beeinträchtigt waren, S-Zellen zu bilden und Giftstoffe (EtBr) abzusondern. Neben der verminderten Fähigkeit, sich gegen K. pneumoniae zu verteidigen, zeigte die aplD--Mutante außerdem einige morphogenetischen Defekte während der Entwicklungsphase. Hierzu gehörten Unterbrechungen in den Hyphen des späten Streaming-Stadiums (12 h), die verzögerte Bildung von kleineren Slugs (18 h) und Fruchtkörpern (~26 h) sowie eine etwas reduzierte Sporenbildungseffizienz. Gleichwohl waren die Morphologie und die Viabilität der Sporen in der aplD--Mutante nicht beeinträchtig. Diese Beobachtungen könnten auf eine zusätzliche Rolle für AplD während der Entwicklungsphase hindeuten. Andererseits wäre es auch denkbar, dass die aplD--Mutante generell immunsupprimiert ist und somit mehrere Entwicklungsdefekte aufweist. Zusammenfassend konnte ich in dieser Arbeit zeigen, dass aplD von entscheidender Bedeutung für das Wachstum von D. discoideum auf K. pneumoniae und auch für das intrazelluläre Töten dieser Bakterien ist. Außerdem ist aplD notwendig, um die Akkumulation von K. pneumoniae in den Slugs von D. discoideum zu verhindern.

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Dhakshinamoorthy, Ranjani: Molecular Characterisation of Antimicrobial Arsenal of Dictyostelium discoideum.

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