Studies on the ammonia permeability of aquaporins

Krenc, Dawid

Ammonia is a molecule similar in size and polarity to water, yet its rate of permeation through water-selective aquaporins (AQP) is comparatively low. The amino acids lining the narrowest region of the water-selective rat AQP1, the so-called aromatic/arginine (ar/R) constriction, were altered by site-directed mutagenesis so as to resemble the corresponding region in the water- and ammonia-permeable human AQP8. The resulting AQP1 mutants were tested for water permeability by osmotic assays with Xenopus laevis oocytes and with protoplasts of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Permeability for ammonia and its analogue methylamine were tested with yeast growth assays. All AQP1 mutants retained water permeability to some degree, even the H180F mutant which is expected to have an ar/R constriction narrower than that of the wild-type channel. Ammonia- and methylamine permeability was found in those AQP1 mutants which had an alanine or isoleucine in place of Histidine 180, the latter being the corresponding amino acid in AQP8. In the case of ammonia, leucine was also permissible. Human and rat AQP8 mutants with histidine in place of Isoleucine 198 and 200, respectively, retained water permeability. Their ammonia and methylamine permeability could not be studied by yeast growth assays. The ammonia influx assay makes use of a yeast strain lacking its ammonium transporters Mep1-3 as well as its ammonia-permeable aquaglyceroporin Fps1. It was found to indicate elevated ammonia tolerance at neutral or mildly alkaline pH, rather than facilitated influx of ammonia as nitrogen source. In addition, replacing ammonium ions by amino acids such as glutamine did not completely abolish this pH-dependent effect. The methylamine efflux assay makes use of a yeast strain lacking its aquaglyceroporin Fps1 which would otherwise allow accumulated toxic methylamine to escape from the cell. It was found to indicate increased tolerance of yeast to pH 6.5 and 7.5, even in the absence of methylammonium in the growth medium. Yeast growth assays and osmotic assays with yeast protoplasts and human erythrocytes were employed for the study of potential inhibitors of human AQP1, AQP9, and of Plas-modium falciparum AQP. The substances had been discovered by collaborators using in silico high-throughput screening. No test compound was found to be active. Inhibition of human AQP1 by mercuric chloride, and of human AQP9 by mercuric chloride and phloretin, was confirmed.

Das Ammoniakmolekül ähnelt dem Wassermolekül hinsichtlich seiner Größe und seiner Polarität. Trotzdem ist seine Permeationsrate durch wasserselektive Aquaporine (AQP) ver-hältnismäßig gering. Die aromatische/Arginin (ar/R)-Konstriktion des wasserselektiven AQP1 der Ratte, wurde durch einzelne sowie durch mehrfache gezielte Punktmutationen von Aminosäuren so geän-dert, dass sie der ar/R-Konstriktion des Wasser und Ammoniak leitenden AQP8 ähnelte. Die erhaltenen AQP1-Mutanten wurden in osmotischen Tests mit Xenopus laevis Oozyten und Protoplasten der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae auf ihre Wasserleitfähigkeit hin untersucht. Ammoniak- und Methylaminleitfähigkeit wurden in Hefewachstumstests geprüft. Alle AQP1-Mutanten wiesen Wasserleitfähigkeit auf, sogar AQP1 H180F, dessen ar/R-Kon-striktion wahrscheinlich schmaler ist als die des Wildtypkanals. Ammoniak- und Methylaminleitfähigkeit wurden festgestellt für AQP1-Mutanten in denen Histidin 180 durch Alanin oder Isoleucin ausgetauscht worden ist. Bezüglich der Ammoniak-leitfähigkeit war Leucin an dieser Stelle ebenfalls einsetzbar. Die Wasserleitfähigkeit des AQP8 des Menschen und der Ratte blieb nach Austausch von Isoleucin 198 bzw. Isoleucin 200 durch Histidin bestehen. Ihre Ammoniak- und Methylamin-leitfähigkeit konnte mittels Hefewachstumstests nicht überprüft werden. Der Ammoniakinfluxtest bedient sich eines Hefestammes welchem die Ammoniumtrans-porter Mep1-3 und das Ammoniak leitende Aquaglyceroporin Fps1 fehlen. Er zeigte eine durch heterologe AQP erhöhte Ammoniaktoleranz bei neutralem oder leicht alkalischem pH an, nicht jedoch den erleichterten Einstrom von Ammoniak als Stickstoffquelle. Außerdem konnte der Austausch von Ammoniumionen durch Aminosäuren, z. B. Glutamin, diesen pH-abhängigen Effekt nicht vollständig eliminieren. Der Methylamineffluxtest bedient sich eines Hefestammes dem das Aquaglyceroporin Fps1 fehlt, welches ansonsten den Ausstrom von aufgenommenem, toxischem, Methylamin ermöglichen würde. Er zeigte eine zusätzliche methylaminunabhängige AQP-vermittelte Toleranz der Hefe gegenüber pH Werten von 6,5 und 7,5 an. Hefewachstumstests und osmotische Tests mit Hefeprotoplasten und humanen Erythro-cyten wurden zur Untersuchung von potentiellen Inhibitoren der humanen Aquaporine AQP1 und AQP9, sowie des Plasmodium falciparum AQP, verwendet. Die Testsubstanzen waren von Kooperationspartnern mittels in silico Hochdurchsatz-Screening gefunden worden. Keine der Substanzen zeigte Aktivität. Die Blockierung von menschlichem AQP1 durch Queck-silber(II)chlorid, sowie von menschlichem AQP9 durch Quecksilber(II)chlorid und Phloretin, konnte bestätigt werden.

Preview

Cite

Citation style:

Krenc, Dawid: Studies on the ammonia permeability of aquaporins. 2012.

Rights

Use and reproduction:
No CC License (german copyright law applies)

Export