Molekulare Mechanismen der Aktivierung von Zielgenen durch Notch1

Bernoth, Kristina

Der Notch-Signalweg ist ein hoch konservierter Zell-Zell-Kommunikationsweg, der von essentieller Bedeutung für die Entwicklung vielzelliger Organismen ist. Er reguliert grundlegende Vorgänge wie Zelllinienentscheidungen, Zelldifferenzierung und Apoptose. Die Signaltransduktion verläuft nach einem vergleichsweise einfachen Schema und kommt ohne sekundäre Botenstoffe aus. Nach Bindung des Liganden wird der Notch-Rezeptor proteolytisch gespalten. Daraufhin transloziert die intrazelluläre Domäne des Notch-Rezeptors in den Zellkern, wo sie über den Transkriptionsfaktor RBP-J die Transkription von Zielgenen aktiviert. Auf diese Weise wird die Expression einer Vielzahl an Genen in einer sehr zellkontextabhängigen Art und Weise reguliert. Bislang ist immer noch wenig über die molekularen Mechanismen und die Regulation der zellkontextabhängigen Effekte von Notch bekannt. Erste Daten zeigen, dass epigenetische Vorgänge wie die Modifikation der Histone eine wichtige Rolle bei der Regulation der Transkription von Notch-Zielgenen spielen. In den Promotorregionen der von uns identifizierten Notch1-Zielgene sind sowohl die aktivierende H3-Trimethylierung von Lysin 4 (H3K4me3) als auch sogenannte bivalente Domänen, also das gleichzeitige Auftreten von aktivierenden (H3K4me3) und reprimierenden (H3K27me3) Modifikationen, vermehrt angereichert. Darüber hinaus konnten wir mehrere potenzielle RBP-J Bindungsstellen in den regulatorischen Bereichen der neu identifizierten Zielgene finden. In der vorliegenden Arbeit wurde mittels ChIP Analyse gezeigt, dass die Aktivierung von Notch1 in ES-Zellen zu einem Anstieg der H3K4me3 Modifikation und zu einem Rückgang der H3K27me3 Modifikation im Bereich der potenziellen RBP-J Bindungsstellen der direkten Notch1-Zielgene Hes5, Sox9 und Pax6 kommt. Die Aktivierung des Notch1-Signalweges in ES-Zellen hat somit einen Einfluss auf die bivalenten Domänen im Promotor seiner Zielgene. In mesodermalen Vorläuferzellen konnte weiterhin beobachtet werden, dass die Anwesenheit von H3K4me3 eine essentielle Voraussetzung für die Aktivierbarkeit der Notch1 induzierten Gene zu sein scheint. Außerdem wurde anhand von Luziferase-Reporter-Assays gezeigt, dass die RBP-J Bindungsstellen nahe des Transkriptionsstartpunktes von Sox9 und Pax6 in ES-Zellen sowie in neuroektodermalen Vorläuferzellen eine essentielle Rolle während der Induktion durch Notch1 spielen. Dabei kommt es zur Kooperation mehrerer Bindungsstellen abhängig vom Zellkontext. Die hier präsentierten Ergebnisse geben einen Einblick in die molekularen Mechanismen der Aktivierung von Notch1-Zielgenen in ES-Zellen und den zellkontextabhängigen Einfluss von Histon-Modifikationen auf die Wirkungsweise von Notch1.

The Notch signaling pathway is a highly conserved signaling mechanism that plays a pivotal role throughout development of multicellular organisms. Notch signaling influences a wide variety of fundamental processes such as cell fate decisions, differentiation, proliferation and apoptosis. The Notch pathway is remarkably simple without second messengers involved. Upon ligand binding, the Notch intracellular domain (NICD) is cleaved from the cytoplasmic membrane and translocates into the nucleus. Here, it binds to DNA via the adapter protein RBP-J and converts it from a transcriptional repressor into an activator. Notch signaling regulates the expression of genes in a highly cell-context dependent manner. However, little is known about the molecular mechanisms and regulation of the cell-context dependent Notch1 effects. Initial evidence suggests that epigenetic events like histone modification are tightly involved in the control of Notch target gene expression. Recently we have shown that the promoter regions of newly identified Notch1 target genes are marked by an enrichment of H3 trimethylation of Lysine 4 (H3K4me3), an activating modification, and bivalent domains, containing an activating (H3K4me3) and repressing (H3K27me3) modification. Furthermore, several potential RBP-J binding sites were found in the regulatory regions of newly identified Notch target genes. Upon activation of Notch1 signaling in embryonic stem cells (ESC) an increase in H3K4me3 and a decrease in H3K27me3 at the potential RBP-J binding sites in the promoter of direct Notch targets Hes5, Sox9 and Pax6 was observed. Thus, Notch1 signaling alters epigenetic marks, in particular the bivalent domains at the regulatory regions of its target genes which may promote gene expression. Furthermore, in mesodermal progenitor cells the presence of H3K4me3 seems to be an essential prerequisite for activation of Notch1 target genes. Moreover, an important role for the RBP-J binding sites proximal to the transcriptional start site of Sox9 and Pax6 could be revealed for Notch1 mediated upregulation in ESC and neuroectodermal progenitors. It was shown that, depending on the cellular context, the RBP-J binding sites act in a cooperative manner to activate gene expression. In conclusion, this study reveals important aspects of the molecular mechanisms during Notch1 target gene activation in ESC and of the chromatin control mechanisms, which set the stage for cell-context dependent expression of Notch1 target genes.

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Bernoth, Kristina: Molekulare Mechanismen der Aktivierung von Zielgenen durch Notch1. 2012.

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