Biochemical and physiological analysis of oncogenic constitutive active variants of gp130

Schütt, Antje Michalea

The IL-6 cytokine family is involved in inflammation, regeneration and tumor formation (23, 144). One characteristic of IL-6 signaling is the requirement of the alpha subunit IL-6R, which exists as a membrane bound as well as a soluble form. The IL-6/IL-6R complex binds to the ubiquitously expressed, signal transducing beta-receptor gp130, leading to gp130 activation and downstream signaling via the intracellular associated Janus kinases (JAKs). Despite the fact that the binding sites of the IL-6/IL-6R complex to gp130 were identified by crystal structure analysis, the molecular mechanism underlying gp130 activation is barely understood. Recently constitutive active deletion mutants of gp130 were found in patients with benign liver adenoma. Theses deletions differ in length as well as in position and cluster around the IL-6 contact site of domain D2. This contact area comprises the EF loop, stabilized by adjacent amino residues in wildtype gp130. Furthermore, the EF loop is connected to the BC loop of domain D3 via hydrophobic interactions. We hypothesized that an inactive gp130 conformation is stabilized via such interactions. Using a rational structure-based mutagenesis approach we could show, that an increased EF loop flexibility as well as interference with the hydrophobic interactions led to ligand independent activation of gp130. In addition we discovered that the D1 domain, in particular the first N-terminal residues were crucial for the ligand independent activity of the gp130 deletion mutants. Based on our results we present a model, which helps to explain the molecular basis of cytokine dependent as well as cytokine independent activation of gp130, presumably providing an insight into the molecular basis of cytokine receptor activation in general. Moreover, we were interested in the physiological consequences of a cell-autonomous, ligand independent activation of gp130 in hepatocytes. We therefore generated transgenic mice, expressing a previously published artificial, constitutive active variant of gp130 (L-gp130) in a tetracycline inducible manner. We intended to use this murine model to study in more depth the impact of hepatocellular signaling on injury induced liver regeneration and tumor promotion. Unfortunately we did not achieve an inducible expression of L-gp130 during our analysis, suggesting that the transgene was silenced after genomic integration. Therefore we are currently generating two alternative murine models to analyze the effect of a cell-autonomous hepatocellular expression of ligand independent gp130 variants.

Die Familie der Interleukin-6 (IL-6) Zytokine spielt eine wichtige Rolle bei Entzündung, Regeneration und Tumorentstehung (23, 144). Die Besonderheit der IL-6 Signalgebung ist, dass IL-6 zuerst an seinen alpha-Rezeptor (IL-6R) binden muss, welcher in membrangebundener und löslicher Form existiert. Dieser Komplex bindet an den ubiquitär expremierten, signalgebenden beta-Rezeptor gp130 und aktiviert die intrazellulär gekoppelten Janus kinasen (JAKs). Obwohl die Bindungsstellen des IL-6/IL-6R Komplexes an gp130 anhand von Strukturanalysen aufgeklärt wurden, ist die molekulare Grundlage der gp130 Aktivierung nach wie vor unklar. Kürzlich wurden konstitutiv aktive Deletionsmutanten von gp130 in Patienten mit benignen Leberadenomen gefunden (130). Die Deletionen variierten in Länge und Position, befanden sich jedoch alle in einem Bereich der D2 Domäne, die als Kontaktstelle für IL-6 identifiziert wurde. Dieser Bereich beinhaltet den EF loop, dessen Konformation durch angrenzende Aminosäuren in Wildtyp gp130 stabilisiert wird. Zudem ist der EF loop über hydrophobe Wechselwirkungen mit dem BC loop der D3 Domäne verbunden. Wir stellten die Hypothese auf, dass eine inaktive gp130 Konformation durch diese Wechselwirkungen stabilisiert wird. Durch rationale strukturbasierte Mutagenese konnten wir zeigen, dass eine erhöhte Flexibilität des EF loops, als auch die Unterbrechung der hydrophoben Interaktionen zu einer liganden-unabhängigen Aktivierung von gp130 führten. Zudem können wir zeigen, dass die D1 Domäne und insbesondere die ersten N terminalen Aminosäurereste eine wichtige Rolle bei der liganden-unabhängigen Aktivierung der gp130 Deletionsmutanten spielt. Aufgrund unserer Befunde können wir ein Modell aufstellen, das versucht, die molekularen Grundlagen der Zytokin-abhängigen, als auch der Zytokin-unabhängigen gp130-Aktivierung zu erklären und somit einen generellen Einblick in die Aktivierung von Zytokinrezeptoren liefert. Wir waren zudem an den physiologischen Konsequenzen einer zell-autonomen, liganden-unabhängigen hepatozytären gp130 Aktivierung interessiert. Wir generierten daher transgene Mäuse mit einer Tetrazyklin-induzierbaren Expression einer kürzlich publizierten artifiziellen, konstitutiv aktiven gp130 Variante (L-gp130). Die Auswirkungen auf die Leberregeneration nach Schädigung, sowie die Entstehung von Lebertumoren sollten anhand dieses murinen Modells ermittelt werden. Im Laufe unserer Analysen zeigte sich allerdings, dass die L-gp130 Expression nicht induzierbar war und der Promotor vermutlich im Genom nicht zugänglich vorliegt. Wir arbeiten daher gerade an zwei alternativen transgenen Mausmodellen zur zell-autonomen Expression liganden-unabhängiger gp130 Varianten.

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Schütt, Antje: Biochemical and physiological analysis of oncogenic constitutive active variants of gp130. 2012.

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