Reduktion von aliphatischen Amidoximen und N-hydroxylierten Basenanaloga durch neue molybdänhaltige Enzymsysteme

Krompholz, Nina

Beide Isoformen des kürzlich entdeckten vierten humanen Molybdoenzyms mARC (mitochondrial Amidoxime Reducing Component), welches zu der neuen Domänen-Superfamilie der MOSC-Proteine zählt, sind zusammen mit den Elektronentransportproteinen Cytochrom b5 und dessen Reduktase an der Reduktion verschiedener N-hydroxylierter Verbindungen beteiligt. In dieser Arbeit konnte die Reduktion des aliphatischen Benzylamidoxims zum entsprechenden Amidin in in vitro Biotransformationsstudien mit porcinen Lebermitochondrien und rekombinanten Enzymquellen gezeigt werden. Die Umsetzungsraten waren dabei vergleichbar mit dem Modellsubstrat Benzamidoxim. Die Reduktion von N-hydroxylierten Verbindungen durch die rekombinanten prokaryotischen MOSC-Proteine YcbX und YiiM konnte in in vitro Studien mit dem Modellsubstrat Benzamidoxim sowie mit N-hydroxylierten Basenanaloga nachgewiesen werden. Durch den Verlust der N-reduktiven Aktivität beim Austausch des für die MOSC-Proteine typischen hochkonservierten Cysteins durch ein Serin kann davon ausgegangen werden, dass sowohl die MOSC-Proteine YcbX und YiiM als auch die eukaryotischen mARC-Proteine zur Sulfitoxidase-Familie gehören. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal eine mögliche physiologische Funktion des mARC-abhängigen Dreikomponenten-Enzymsystems beschrieben. Dabei konnte nicht nur die Reduktion der mutagenen und toxischen N-hydroxylierten Nucleobasen N-Hydroxycytosin und N-Hydroxyadenin sowie der Nucleoside N-Hydroxycytidin und N-Hydroxyadenosin sondern auch des Nucleotids N-Hydroxy-AMP zu den entsprechenden physiologischen Verbindungen gezeigt werden. Die N-reduktive Aktivität war in den Mitochondrien angereichert, wobei mit Enzymquellen aus Leber, Niere, Schilddrüse und Pankreas jeweils die höchsten Umsetzungen erzielt wurden. Mit beiden rekombinanten mARC-Isoformen konnte eine Umsetzung gezeigt werden, wobei das humane mARC1 die effizientere Isoform darstellte. Die Umsetzungsrate nahm dabei von der Nucleobase über das Nucleosid zum Nucleotid hin ab.

The two newly discovered isoforms of the mitochondrial Amidoxime Reducing Component (mARC), which belong to the MOSC domain superfamily, are the fourth human molybdenum enzymes and catalyse together with their electron transport proteins cytochrome b5 and NADH cytochrome b5 reductase the reduction of different N-hydroxylated compounds. The reduction of the aliphatic benzylamidoxime to the corresponding amidine was demonstrated in in vitro studies with porcine liver mitochondria and the recombinant three component enzyme system. The reduction rate was comparable with the model substrate benzamidoxime. The reduction of N-hydroxylated compounds by the recombinant prokaryotic MOSC proteins YcbX and YiiM was demonstrated in in vitro studies with the model substrate benzamidoxime and N-hydroxylated base analogues. Due to a loss of activity by substituting the absolutely conserved cysteine for a serine, it can be assumed that the MOSC-proteins YcbX and YiiM but also the eukaryotic mARC proteins belong to the sulfite oxidase family. In this study a possible physiological function of the mARC-containing enzyme system was described. The reductive detoxification of the toxic and mutagenic N-hydroxylated nucleobases N-hydroxycytosine and N-hydroxyadenine and the nucleosides N-hydroxycytidine and N-hydroxyadenosine as well as the nucleotide N-hydroxy-AMP to their corresponding endogenous compounds by the mARC-containing enzyme system was demonstrated. The N-reductive activity was most pronounced in enriched mitochondrial fractions with the highest conversion rates being detectable by enzyme sources of liver, kidney, thyroid, and pancreas. In vitro assays with the respective recombinant three component enzyme system showed that both mARC enzymes are able to reduce N-hydroxylated base analogues with the human mARC1 representing the more efficient isoform. The reduction rate decreased from the nucleobase over the nucleoside to the nucleotide.

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Krompholz, Nina: Reduktion von aliphatischen Amidoximen und N-hydroxylierten Basenanaloga durch neue molybdänhaltige Enzymsysteme.

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