Expression, Reinigung und strukturelle Charakterisierung von Upd3, Aktivator der Jak/Stat-Signalweges in Drosophila

Der Jak/Stat-Signalweg kann in Drosophila von drei Unpaired (Upd)-Proteinen aktiviert werden. Während Upd und Upd2 wichtig für die embryonale Entwicklung sind, spielt Upd3 eine Rolle bei der Immunantwort und der Darm-Homöostase (Agaisse, Petersen et al. 2003). Aufgrund seiner Funktion in der Immunantwort und seiner potentiellen Orthologie zu IL-6 der Vertebraten, wurde der Schwerpunkt in dieser Arbeit auf Upd3 gelegt. Während Upd und Upd2 Signalsequenzen besitzen und sekretiert werden, konnte bei Upd3 keine Signalsequenz identifiziert werden. Mittels Durchflusszytometrie konnte Upd3 an der Oberfläche von transfizierten HEK-293T- und S2-Zellen nachgewiesen werden. Des Weiteren konnte mit dieser Methode der N-terminale Teil von Upd3 ausschließlich im Inneren der Zellen nachgewiesen werden. Außerdem konnte Upd3 nicht durch einen hohen pH-Wert von isolierten Membranen gelöst werden, was eine Assoziation von Upd3 mit der Membran ausschließt. Diese Untersuchungen lieferten Hinweise darauf, dass Upd3 ein Typ II Transmembranprotein sein könnte. Ob Upd3 von der Membran gespalten wird, ist jedoch unklar. Über die Struktur der Unpaired-Proteine ist außer Vorhersagen noch nichts bekannt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Schwerpunkt auf die Reinigung und strukturelle Charakterisierung von rekombinantem Upd3 gelegt. Bei der Klonierung des Upd3-Konstrukts wurde auf die mögliche Signalsequenz bzw. den intrazellulären Bereich und den Transmembranbereich verzichtet. Es konnte gezeigt werden, dass der restliche Teil des Proteins bzw. der vermutete extrazelluläre Bereich genügt, um den Jak/Stat Signalweg zu aktivieren. Für die Produktion von Antikörpern wurde mit Thioredoxin markiertes Upd3 (Trx-Upd3) verwendet. Die Reinigung von rekombinantem Protein für die Strukturaufklärung erfolgte mit einem Konstrukt ohne Thioredoxin-tag (His-Upd3). Mittels Zirkulardichroismus wurde gezeigt, dass der vermutlich extrazelluläre Teil von Upd3, wie erwartet, α-helikale Strukturen aufweist. Analysen von proteolytisch generierten Peptiden des gereinigten His-Upd3 mittels Massenspektrometrie ergaben, dass Cys129 und Cys387 durch Disulfidbrücken miteinander verbunden sind, Cys146 und Cys271 hingegen in ihrer reduzierten Form vorliegen. Für das rekombinante His-Upd3 konnte ein Reinigungsprotokoll etabliert werden. Ein erstes NMR-Spektrum konnte anschließend von 13C und 15N Isotopen markiertem His-Upd3 für die Strukturaufklärung generiert werden. Für eine endgültige Strukturaufklärung müssen jedoch, auf Grund der Größe des Proteins, Aminosäure-spezifische Markierungen vorgenommen werden.

The Jak/Stat pathway in Drosophila is activated by three Unpaired (Upd) proteins. Whereas Upd and Upd2 are important for embryonic development, Upd3 has been shown to play a role in gut homeostasis and immune response (Agaisse, Petersen et al. 2003). Due to the role in immune response and its potential orthology to IL-6, our work was focused on Upd3. Whereas Upd and Upd2 contain a signal sequence and are secreted proteins, Upd3 is lacking a typical signal sequence. Upd3 was detected on the cell surface of transfected HEK 293T and S2 cells via flow cytometry. Furthermore, Upd3 was not released from isolated membranes after several washing steps at high pH. These observations gave hints that Upd3 could be a type-II-transmembrane protein. However, it is still unclear, if Upd3 is cleaved of from the membrane by a protease. Up to now, the structure of the unpaired proteins has not been revealed. Therefore we aimed to purify and structurally characterize the recombinant Upd3. The cloned Upd3 construct lacked the possible signal sequence or the predicted intracellular region and transmembrane region. This construct, containing the extracellular part of Upd3, was able to activate the Jak/Stat pathway. For the production of antibodies against Upd3, a fusion protein composed of thioredoxin, a His-tag and the extracellular part of Upd3 was used. An Upd3 construct without thioredoxin-tag was generated for structural characterization (His-Upd3). Measurements of the circular dichroism showed that the predicted extracellular part of Upd3 consisted of α-helices. Proteolytic peptide analysis and mass spectrometry predicted the existence of a disulfide bond between Cys129 and Cys387, while Cys146 und Cys271 where reduced. With the help of recombinant His-Upd3, a purification protocol was established and first NMR spectra of 13C- and 15N-isotope labeled Upd3 were acquired. For final structural characterization amino-acid specific labeling has to be performed, due to the large size of Upd3.

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