The bivalve Laternula elliptica : physiological and molecular response to changing coastal Antarctic environments

Husmann, Gunnar

Increasing temperatures and glacier-disintegration at the Western Antarctic Peninsula (WAP) are presently altering environmental conditions in shallow coastal areas. Rising water temperatures, enhanced ice scouring impacts as well as increasing input of inorganic sediments from melt water runoff are anticipated to particularly affect slow growing sessile benthic filter feeders like the Antarctic soft shell clam Laternula elliptica, a long-lived species which is a major component of the nearshore benthic infauna. In order to address the question of how populations will be affected by current and future changes of the nearshore environment, this thesis set out to investigate a suite of whole organismic, biochemical, cellular and molecular responses of L. elliptica under effects of increased turbidity, ice scouring and food restriction particularly focusing on age-specific sensitivities. Behaviour, metabolism, cellular accumulation of metals as well as oxidative stress markers were investigated in young and old individuals from two field-stations of the Potter Cove (King George Island/Isla 25 de Mayo, WAP), which are characterized by different scales of turbidity or ice scouring. Comparison of age-related responses pointed out younger individuals coped better with high turbidity, as seen on their stable respiration rates and were able to selectively survive effects of ice scouring, as indicated by their higher reburrowing activity and higher survival rates after injury, compared to older individuals. Also cellular products of oxidative stress (lipofuscin) and most metals investigated were found to be age-related and accumulate over lifetime whereas higher sedimentation or physiological stress due to ice scouring could not consistently be related to these markers (lipofuscin, protein carbonyls, metals). Tissue trace metal content rather seems to originate from the water column or food source than from sedimentation per se. The comparison of animals from both field stations suggest that inorganic turbidity and ice-impact close to a glacier might affect lifetime growth, contribute to a decreasing physiological state in older animals which may lead to a selective survival of younger individuals finally decreasing populations lifespan and abundance. To further understand basic cellular functioning of the L. elliptica stress and immune defense, hemocyte (immunocytes) responses under physical stress and microbial exposure were investigated. On the one hand cellular responses to microbial stimuli were characterized in vitro, on the other hand food restriction and injury experiments were undertaken using different age classes of L. elliptica, in order to study age-dependent in vivo responses of cellular immunity (abundance of free circulating hemocytes). Hemocytes of L. elliptica featured common immune functions such as adsorption, immobilization, phagocytosis of microbes and particles, as well as the generation of reactive oxygen species (ROS). Younger clams had lower numbers of hemocytes but higher basal and stimulated (zymosan) ROS generation per cell compared to older clams, indicating changes in immune response capacities over lifetime. Trends of increasing numbers of free floating hemocytes under extrinsic factors such as experimentally increased food supply or injury showed that characteristics of hemocyte mediated immune responses in L. elliptica are influenced by the animals' physical state and subject to environmental changes. For the molecular investigation of the L. elliptica stress response a mRNA sequence dataset was generated from hemocytes and tissues of stress challenged (injury, food restiction) individuals using 454 sequencing. The annotated dataset was searched for genes with putative functions in immune and stress responses as well as metabolism. Expression changes of selected candidate genes were investigated in hemocytes, siphon and digestive gland of young and old individuals subjected to food restriction and injury treatments. Selected genes were rather affected by injury than by starvation, but the effect of injury was modulated by the nutrition treatment. Particularly in hemocytes of younger, fed individuals, expression levels increased after acute injury, whereas in young starved or old individuals only minor expression changes could be observed. The stress response of L. elliptica thus depends not only on the nature of the environmental cue but particularly on age. Low effects of food-restriction on physiological state and gene expression were ascribed to the species adaptation to characteristics of the Antarctic environment including low metabolic rates and might go hand in hand with the enhanced capability to survive under unfavourable environmental conditions. The overall results indicate that the physiological state and stress response of L. elliptica is connected with environmental stress levels but is even higher related to the individuals´ age. Age related differences in burrowing activity, tissue proliferation rates, oxidative stress and stress response may lead to specific survival of younger individuals under the ongoing changes at the WAP coastal ecosystems thus affecting L. elliptica population age demographics and abundance and with this the benthic ecosystem this key-species is living in.

Steigende atmosphärische Temperaturen sowie ein massives Abschmelzen lokaler Gletscher führen in küstennahen Schelfgebieten der westantarktischen Halbinsel (WAP) zu komplexen Veränderungen der Umweltbedingungen. Gerade langsam wachsende, sessile Filtrierer wie die antarktische Schlickmuschel Laternula elliptica, könnten durch einen hierdurch bedingten Anstieg der Wassertemperaturen, vermehrten Eintrag anorganischer Sedimente sowie zunehmende Störung durch flottierende Eismassen betroffen sein. L. elliptica ist ein langlebiger Vertreter des Makrobenthos, der zirkumpolar verbreitet ist und in einigen Bereichen der WAP das küstennahe Endobenthos dominiert. In der vorliegenden Arbeit sollten sowohl organismische, biochemische, zelluläre als auch molekulare Untersuchungen Aufschluss über die physiologische Reaktion von L. elliptica Individuen auf mögliche Stressfaktoren im Bereich eines zurückgehenden Gletschers geben. Die Untersuchung unterschiedlich alter Individuen sollte Effekte auf die physiologische Fitness und das Überleben verschiedener Altersgruppen erfassen. Im ersten Teil der Arbeit wurden zwei Subpopulationen von L. elliptica beprobt, die in der Potter Cove (King George Island/Isla 25 de Mayo, WAP) sowohl den Stressfaktoren Sedimenteinfluss als auch Eisgang unterschiedlich stark ausgesetzt sind. Anhand von Markern bezüglich des Verhaltens, des Metabolismus, der zellulären Anreicherung von Metallen aus dem Habitat, sowie des zellulären oxidativen Stresses sollte der physiologische in situ-Status dieser beiden Subpopulationen erfasst werden. Hierbei zeichnete sich bei einem Vergleich der Altersgruppen ab, dass jüngere L. elliptica im Gegensatz zu den älteren Individuen unter starker mineralischer Trübung stabile Respirationsraten aufrechterhalten konnten. Vielfach höhere Überlebensraten nach Verletzungen, sowie ausgeprägtere Fähigkeiten, nach der Störung durch strandendes Eis in den Boden zurückzukehren, deuteten zusätzlich daraufhin, das jüngere Individuen eher in der Lage sein könnten, diese Störungen selektiv zu überstehen. Eine Altersabhängigkeit wurde auch auf der Ebene der Konzentration zellulärer Marker gezeigt, wobei im Fall von Lipofuszin, einem Marker oxidativen Stresses, sowie der meisten untersuchten Metalle mit dem Alter eine Zunahme beobachtet wurde. Innerhalb der stärker beeinflussten Subpopulation konnten dem direkten Einfluss des abschmelzenden Gletschers keine einheitlichen Effekte auf zelluläre Marker oxidativen Stresses (Lipofuszin, Proteincarbonyle) zugeschrieben werden. Auch führte in L. elliptica die direkte Nähe zu den Hauptabflüssen von Schmelzwasser und erodierter vulkanischer Sedimente nicht zu einer Gewebe-Anreicherung von Metallen aus dem Habitat. Ein bestimmender Faktor war hier stattdessen wiederum das Alter der Tiere. Auch scheint die Metallanreicherung innerhalb der untersuchten Gewebe eher aus der Wassersäule oder aus der Nahrung zu stammen und nicht durch Sedimentaufnahme bedingt zu sein. Insgesamt deuteten diese Ergebnisse daraufhin, das ein Sedimentabfluss vom Gletscher kaum zu kurzfristigen Veränderungen in der Metallakkumulierung führt, sich andererseits aber langfristig auf Parameter wie die Wachstumsrate oder die Gesamtbilanz physiologischen Stresses (Lipofuszin) auswirken könnte. Ein verschlechterter physiologischer Zustand, der sich in älteren Tieren zeigte, könnte in Gebieten starker Gletscherabflüsse und gleichzeitig hohem Störungsaufkommen durch strandende Eis-Massen insgesamt zu einer Veränderung der Populations-Demographie und gleichzeitig rückgängigen Abundanzen beitragen. Um im Kontext rapider Umweltveränderungen zelluläre Stressreaktionen von L. elliptica besser einschätzen zu können, wurden im zweiten Teil der Arbeit basale Parameter der Stress- und Immun-Antwort charakterisiert, wobei der Fokus auf den zirkulierenden Immunocyten (Hämocyten) lag. Hierzu wurden einerseits die zelluläre Reaktionen auf mikrobielle Stimulation in vitro charakterisiert, andererseits wurden verschieden alte Tiere experimentell unter Nahrungsmangel sowie künstlichen Verletzungen gehalten, um eine mögliche zelluläre Antwort in vivo zu charakterisieren. Hämocyten von L. elliptica zeigten generelle Funktionen wie Adsorption, Immobilisierung und Phagocytose von Bakterien und Partikeln, sowie Generierung von reaktiven Sauerstoffradikalen (ROS). Spezifische Marker der Evertebraten-Immunität (Hämocyten-Konzentration und ROS-Generierung) waren altersabhängig. Jüngere Individuen wiesen eine geringere Hämocyten-Konzentrationen, jedoch eine höhere ROS-Produktion pro Zelle (stimuliert und unstimuliert) gegenüber älteren Individuen auf. Ein erhöhtes Nahrungsangebot sowie künstlich herbeigeführte Verletzung führte zu einer Zunahme der Hämocyten-Konzentration innerhalb der Hämolymphe. Dies deutete auf einen direkten Einfluss externer Faktoren wie Nahrungsangebot auf Immunparameter dieser Spezies hin. Für die Charakterisierung molekularer Stress-Reaktionen wurde mittels 454-Sequenzierung eine mRNA Sequenz-Datenbank erstellt. Dafür wurde sowohl RNA aus Hämocyten als auch aus verschiedenen Geweben künstlich verletzter und gehungerter L. elliptica verwendet. Die Analyse der Expression von Genen, die aufgrund ihrer Homologie zu funktionell stress-kompensatorischen Genen anderer Organismen identifiziert werden konnten, deutete ebenfalls auf eine Altersabhängigkeit der Stressreaktion hin. Eine signifikante Hochregulierung zeigte sich nur in den Hämocyten verletzter Individuen der jüngeren Altersgruppe, wobei diese Reaktion vom experimentellen Nahrungsangebot abhängig war. Im Gegensatz hierzu konnte weder in den Hämocyten oder im Siphogewebe älterer Tiere, eine differentielle Expression nach Verletzung nachgewiesen werden. Auch konnten in den Mitteldarmdrüsen gehungerter Tiere kaum relevante Expressionsänderungen von metabolischen Genen nachgewiesen werden. Die geringen Effekte experimenteller Nahrungsknappheit auf Physiologie und Genexpression in L. elliptica könnten mit der evolutionären Anpassung an die spezifischen Umweltbedingungen der maritimen Antarktis erklärt werden, die durch Reduktion basaler Stoffwechselfunktionen geprägt ist, um somit ein Überleben zu sichern. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten daraufhin, das sowohl physiologische Parameter wie Wachstumsraten oder oxidativer Stress, als auch physiologische Stressreaktionen von L. elliptica durch externe Stressfaktoren wie starke Trübung durch inorganische Sedimente oder strandendes Eis beeinflusst werden, wobei diese Faktoren wesentlich größeren Ausmaßes vom individuellen Alter geprägt sind. Ein höheres Stresskompensationspotenzial jüngerer Individuen könnte zum selektiven Überleben jüngerer Altersgruppen und somit zu einer Veränderung der Altersstruktur in Populationen führen, die vom Wandel der Umweltbedingungen in Flachwasserökosystemen besonders betroffen sind.

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Husmann, Gunnar: The bivalve Laternula elliptica. physiological and molecular response to changing coastal Antarctic environments. 2013.

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