ADP-abhängige Acyl-CoA Synthetasen in Archaea, Bacteria und Eukarya:Charakterisierung, Funktion und Phylogenie

ADP-bildende Acetyl-CoA Synthetasen (ACD) gehören wie die Succinyl-CoA Synthetasen (SCS) zur Proteinfamilie der NDP-bildenden Acyl-CoA Synthetasen. Beide Enzyme sind ubiquitär in allen drei Domänen des Lebens vorhanden und katalysieren die NDP- und Pi-abhängige Umsetzung von Acyl-CoA Estern (Acetyl-CoA bzw. Succinyl-CoA) zu den kor-respondierenden Säuren unter der Bildung von NTP über Substratstufenphosphorylierung. Die ACD-Reaktion wurde erstmals in dem Acetat bildenden Protisten Entamoeba histolytica beschrieben, nicht aber charakterisiert. Erste detaillierte Analysen von ACDs in Prokaryoten wurden in dem hyperthermophilen Archaeon Pyrococcus furiosus durchgeführt und dabei zwei α2β2-heterotetramere ACD-Isoenzyme - ACDI und ACDII - identifiziert, die sich hin-sichtlich ihres Substratspektrums und ihrer kinetischen Konstanten unterscheiden. Ein weite-res ACD-Isoenzym wurde in Thermococcus kodakaraensis charakterisiert, welches mit hoher Effizienz Succinat umsetzt. Es ist bisher nicht bekannt, welche Untereinheit in ACDs die Substratspezifität determiniert. Inzwischen wurde die ACD in allen untersuchten Acetat bildenden Archaea identifiziert und eine Funktion bei der Säurebildung während des Kohlenhydrat- und Peptidabbaus wurde nachgewiesen. Kürzlich wurden auch im Genom des Korarchaeoten Candidatus Korarchaeum cryptophilum, einem sehr ursprünglichen Organismus, vier ACD-Homologe und ein SCS-Homolog identifiziert, deren Funktion bislang unklar ist. Auch in einigen Acetat bildenden Bakterien, wie z.B. Chloroflexus aurantiacus, finden sich Gene für ACDs, deren Funktion aber unbekannt ist. In anderen Bakterien, wie Pseudomonas mendoci-na und Delftia acidovorans, weisen funktionelle Analysen darauf hin, dass ACD-Homologe, anders als in Archaea, an der Aktivierung bestimmter Säuren wie Pimelat und Ferulat beteiligt sind. Je nach Substrat werden diese Enzyme als Pimeloyl-CoA Synthetase (PCS) oder als Feruloyl-CoA Synthetase (FCS) bezeichnet. Zu diesen Enzymen liegen nur wenige biochemi-sche Daten vor. Insbesondere wurde bislang noch keine FCS biochemisch charakterisiert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle und Funktion von Acyl-CoA Synthetasen in den drei Domänen des Lebens untersucht. ACD in Archaea. ACD in P. furiosus. Es sollte geprüft werden, ob P. furiosus ein ACD-Isoenzym enthält, das effizient Succinat umsetzt. ORF Pf_0233 und Pf_1837 wurden kloniert und heterolog in E. coli exprimiert. Das gereinigte, rekonstituierte ACD-Isoenzym zeigte eine siebenfach höhe-re Aktivität mit Succinat als mit Acetat, was das Enzym als ACDsucc klassifiziert. Die ACD könnte daher, wie für T. kodakaraensis gezeigt, am Abbau von Glutamat zu Succinat beteiligt sein. Durch Erstellung chimärer ACDs aus den Untereinheiten zweier ACD-Isoenzyme sollte der Einfluss der Untereinheiten auf die Substratspezifität von ACDs untersucht werden. Mit je einer α- und β-Untereinheit von ACDI und ACDsucc wurden vier aktive α2β2-heterotetramere Enzyme rekonstituiert und hinsichtlich ihres Substratspektrums analysiert. Eine Chimäre aus ACDsuccα und ACDIβ ergab ein zur ACDsucc identisches Substratspektrum, während eine Kombination der ACDIα mit der β Untereinheit der ACDsucc ein Substratspektrum wie die ACDI zeigte. Die Ergebnisse der Untersuchungen der ACD-Chimären weisen darauf hin, dass das Substratspektrum der ACDs in P. furiosus durch die α-Untereinheit determiniert wird. ACDs und SCS in Ca. K. cryptophilum. Im Genom des hyperthermophilen Korarchaeoten Ca K. cryptophilum, der zu den ursprünglichsten Organismen zählt, sind Homologe von vier ACDα- und einer ACDβ Untereinheit sowie die Untereinheiten einer SCS annotiert. Die ACD-Untereinheiten wurden getrennt exprimiert, gereinigt und zu vier α2β2-heterotetrameren ACD-Isoenzymen rekonstituiert. Es konnten dabei drei aktive hyperthermophile ACDs (Topt = 85 °C) charakterisiert werden (ckcACD1, ckcACD3 und ckcACD4). Die ckcACD2 zeigte keine Aktivität. Bei ckcACD1 und ckcACD4 handelt es sich um ACDs mit einem neu-artigen Substratspektrum, die Arylsäuren sowie verzweigte und unverzweigte Acylsäuren und deren korrespondierende CoA-Ester als Substrat verwenden. Die ckcACD3 setzte hingegen effektiv Acetyl-CoA bzw. Acetat um und zeigte keine Aktivität mit Arylsäuren. Die α- und die β Untereinheit der SCS wurden getrennt exprimiert, gereinigt und zu einem aktiven 134 kDa α2β2-Heterotetramer rekonstituiert. Die hyperthermophile SCS (Topt ~ 85 °C) zeigte eine hohe Spezifität für Succinyl-CoA und Succinat. Genomanalysen sprechen dafür, dass die ACDs und die SCS eine zentrale Rolle bei der Energiekonservierung im Zuge der Peptid-fermentation spielen. ACD in M. mazei. Die Gene der getrennt vorliegenden ACDα- und ACDβ-Untereinheiten MM_0358 und MM_0493 wurden kloniert, heterolog in E. coli exprimiert, gereinigt und als aktive ACD rekonstituiert. Das 170 kDa-Enzym (α2β2) katalysierte die Umsetzung von Ace-tyl-CoA und Isobutyryl-CoA mit gleicher Effizienz, Phenylacetyl-CoA wurde nicht akzep-tiert. Die ACD katalysierte mit geringerer Aktivität auch die Säureaktivierung. ACD in Eukarya. ACD in E. histolytica. Die ACD aus E. histolytica wurde heterolog exprimiert, gereinigt und als 164 kDa Homodimer charakterisiert. Neben Acetat bzw. Acetyl-CoA setzte die ACD auch die Säuren Propionat und Thioglycolat um. Verzweigte Acylsäuren und Arylsäuren sowie deren CoA-Ester wurden nicht akzeptiert. Das Substratspektrum des Enzyms und Genomana-lysen lassen auf eine physiologische Rolle bei der Glucose- und Peptidfermentation zu Acetat und Propionat schließen. ACD-Homologe in Bacteria. ACD in C. aurantiacus. Im Genom von C. aurantiacus finden sich keine Gene für die typi-schen Enzyme bakterieller Acetatbildung, Phosphotransacetylase (PTA) und Acetatkinase (AK), jedoch ein ACD-Homolog. Durch Wachstumsexperimente und Zellsuspensionen wurde die Acetatbildung aus Glucose in C. aurantiacus analysiert. Pro Mol Glucose wurden bis zu 1.2 Mol Acetat gebildet. In Zellextrakten konnten keine Aktivitäten von AK und PTA nach-gewiesen werden, aber eine durch Glucose induzierte ACD-Aktivität. Das Enzym wurde aus auf Glucose gewachsenen Zellen gereinigt und das kodierende Gen als Caur_3920 identifi-ziert. Mit einem Molekulargewicht von 300 kDa wies das Enzym eine für ACDs ungewöhnliche homotetramere Struktur auf. Die rekombinant exprimierte ACD setzte ähnlich der ACDI aus P. furiosus mit hoher Aktivität Acetyl-CoA und nur mit geringer Effizienz Phenylacetyl-CoA um. Diese Ergebnisse sprechen für eine funktionelle Beteiligung der ACD bei der Ace-tatbildung aus Glucose. Dies ist der erste Nachweis einer funktionellen ACD in der Domäne der Bacteria. Phylogenetische Analysen deuten darauf hin, dass das acd-Gen über lateralen Gentransfer von Archaea aufgenommen wurde, um das Fehlen von AK und PTA zu komple-mentieren. PCS in Ralstonia eutropha. Im Genom von R. eutropha wurden bei Sequenzvergleichen zwei putative PCSs identifiziert, die als RaPCS1 und RaPCS2 gereinigt und charakterisiert wurden. Beide rekombinanten Enzyme bilden Homodimere und setzen mit der höchsten spezifischen Aktivität Pimelat, HSCoA und ATP zu Pimeloyl-CoA, ADP und Phosphat um. Damit konn-ten erstmals ADP-bildende PCSs nachgewiesen werden. Neben Pimelat (9.5 U/mg = 100 %) setzte die RaPCS1 auch Adipat, Phenylacetat, Isobutyrat und Thioglycolat mit über 30 % der Rate um. Die RaPCS2 nutzte neben Pimelat (11.5 U/mg) nur Butyrat effizient. Keine der PCS konnte die CoA-Ester Acetyl-CoA, Isobutyryl-CoA oder Phenylacetyl-CoA umzusetzen, was darauf hindeutet, dass die PCS ausschließlich an der Säureaktivierung beteiligt ist. Alle bis-lang charakterisierten ACDs enthalten zwei katalytisch essentielle Histidine, die auch in PCS hochkonserviert sind. Mittels ortsspezifischer Mutagenese wurden beide Histidine jeweils gegen Alanin ausgetauscht, was in beiden Fällen zum Verlust der PCS-Aktivität führte. Dies lässt auf eine essentielle Beteiligung beider Histidine an der Pimelataktivierung schließen. Phylogenetische Analysen deuten darauf hin, dass PCSs gemeinsam mit FCS eine distinkte phylogenetische Gruppe innerhalb der ACD-homologen Acyl-CoA Synthetasen bilden. FCS in D. acidovorans. Die rekombinante FCS ist ein 170 kDa Homodimer und katalysiert die Umsetzung von Ferulat, HSCoA und ATP zu Feruloyl-CoA, ADP und Pi. Das Enzym ist hoch spezifisch für Ferulat (Km = 4 µM). Neben Ferulat (12 U/mg = 100 %) setzt die FCS nur Adipat (7 %), Butyrat (12 %) und Pimelat (4 %) mit geringer Effizienz um. Damit konnte erstmals eine ADP-bildende FCS charakterisiert werden.

The family of NDP-forming acyl-CoA synthetases comprises, amongst other synthetases, succinyl-CoA synthetases (SCS) and acetyl-CoA synthetases (ACD). Both enzymes are ubiq-uitous in the three domains of life, catalysing the NDP- and Pi-dependent conversion of acyl-CoA esters (succinyl-CoA or acetyl-CoA) to the corresponding acids while coupling the reac-tion with the formation of NTP by substrate level-phosphorylation. ACD-activity was first detected in the acetate-forming eukaryote Entamoeba histolytica, but the enzyme has not been characterised so far. The first detailed description of ACDs in pro-karyotes was carried out in the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus, where two α2β2 heterotetrameric isoenzymes (ACDI and ACDII) were distinguished in respect to their substrate specificity and kinetic constants. Another ACD-isoenzyme was characterised in Thermococcus kodakaraensis, which catalyses the conversion of succinate to succinyl-CoA with high efficiency. It has still not been solved which subunit determines the substrate speci-ficity of ACDs. In all acetate-forming archaea studied so far, ACDs have been identified and an acid-forming function during fermentation of carbohydrates and peptides has been shown. Recently four ACD-homologues and an SCS-homologue were identified in the genome of the primordial organism Candidatus Korarchaeum cryptophilum but the function of these homo-logues is still unsolved. Genes for ACDs can also be found in some acetate-forming Bacteria like Chloroflexus aurantiacus, but their function is yet unknown. Functional analyses of ACD-homologues in other bacteria like Pseudomonas mendocina and Delftia acidovorans provide evidence that these ACD-homologues are involved in the activation of certain acids like pimelate and ferulate, in contrast to archaea. According to their substrate these enzymes are referred to as pimeloyl-CoA synthetase (PCS) or feruloyl-CoA synthetase (FCS). Only little data are available for these enzymes. Especially no biochemical characterisation of FCS has been performed so far. This study aimed to investigate the roles and possible functions of acyl-CoA Synthetases in the three domains of life. ACD in Archaea. ACD in P. furiosus. It had to be tested, if P. furiosus contains an ACD-isoenzyme that effi-ciently converts succinate to succinyl-CoA. ORF Pf_0233 and Pf_1837 were cloned and ex-pressed heterologous in E. coli. The purified ACD-isoenzyme showed a seven fold higher activity with succinate than with acetate, classifying the enzyme as an ACDsucc. According to these results it might be possible that the enzyme participates in degradation of glutamate to succinate. In order to study the influence of the subunits on substrate specificity of ACDs, four chimeric ACDs were constructed out of the subunits of two ACD-isoenzymes in P. furiosus. Four active α2β2-heterotetrameric enzymes were reconstituted, each with an α- and a β-subunit of ACDsucc and ACDI respectively, and they were analysed in regard to their substrate specificity. A chimaera of ACDsuccα and ACDIβ showed the same substrate specific-ity as ACDsucc did, whereas a combination of ACDIα and ACDsuccβ exhibited the same sub-strate specificity as ACDI did. The data indicate that substrate specificity of ACDs is determi-nated by the α subunit. ACD and SCS in Ca. K. cryptophilum. In the genome of the hyperthermophilic korarchaeon Ca. K. cryptophilum, one of the most primordial organisms discovered so far, four homo-logues of an ACDα- and a homologue of an ACDβ subunit, as well as both subunits of a SCS, are annotated. All of the ACD-subunits were expressed and purified separately and subse-quently reconstituted to four α2β¬2-heterotetrameric ACD-isoenzymes. Three active hyper-thermophilic ACDs (Topt = 85 °C) could be characterised (ckcACD1, ckcACD3, ckcACD4), while ckcACD2 showed no activity. As the two enzymes ckcACD1 and ckcACD4 catalysed the reaction primarily with arylic acids, as well as with unbranched and branched chain fatty acids and the corresponding CoA-esters, they showed a novel type of substrate specificity for ACDs. In contrast ckcACD3 catalysed predominantly the conversion of acetyl-CoA and ace-tate and showed no activity with arylic acids. The α- and β-subunit of the SCS were separately expressed, purified and subsequently reconstituted to an active 134 kDa α2β2-heterotetramere. The hyperthermophilic SCS exhibited high specificity for succinyl-CoA and succinate. Analy-ses of the genome indicate that these ACDs and the SCS play a central role in energy-conservation during the fermentation of peptides. ACD in Methanosarcina mazei. The genes MM_0358 and MM_0493, encoding the putative α- and β-subunit are situated separately in the genome. The genes were cloned, expressed het-erologous in E. coli, purified and reconstituted as an active ACD. The 170 kDa enzyme (α2β2) catalysed the conversion of acetyl-CoA and isobutyryl-CoA with the same efficiency, whereas phenylacetyl-CoA was not converted. The enzyme converted the activation of the corresponding acids only with low efficiency. There is no evidence in the present data to con-clude a metabolic function. ACD in Eukarya ACD in E. histolytica. After heterologous expression in E. coli the ACD from E. histolytica was purified and characterised as a 164 kDa homodimere. In addition to acetate and acetyl-CoA respectively, the ACD effectively utilizes propionate and thioglycolate as substrate. Branched-chain fatty acids and arylic acids as well as the corresponding CoA-esters were not accepted. The substrate specificities, in accordance with genomic studies, suggest a physio-logical role of the ACD in the fermentation of glucose and peptides to acetate and propionate. ACD-homologues in bacteria. ACD in C. aurantiacus. The genes for acetate kinase (AK) and phosphotransacetylase (PTA), the typical enzymes of acetate formation in bacteria, are missing in C. aurantiacus, yet an ACD-homologue can be found. The formation of acetate from glucose in C. aurantiacus was analysed by growth experiments and cell suspensions. Per mole of glucose 1.2 moles of ace-tate were formed. No activity of AK and PTA could be measured in cell-free extracts, but an inducible activity of an ACD was detected. The enzyme was purified from cells grown on glucose and the gene encoding the ACD was identified as Caur_3920. The molecular mass of the enzyme was determined as 300 kDa, indicating a heterotetrameric structure, which is quite unusual for ACDs. The recombinant ACD showed high activity with acetyl-CoA but only low activity with phenylacetyl-CoA, thus its substrate specificity is similar to that of ACDI from P. furiosus. These results indicate an implication of the ACD in acetate formation from glu-cose. This is the first report ever of a functional ACD in the bacterial domain. Phylogenetic analyses suggest that the acd-gene was adapted from archaea by horizontal gene transfer to complement the absence of AK and PTA. PCS in Ralstonia eutropha. Sequence comparison led to the identification of two putative PCSs in the genome of R. eutropha which were purified and characterised as RaPCS1 and RaPCS2. Both recombinant enzymes are homodimers and catalysed with highest specificity the conversion of pimelate, HSCoA and ATP to pimeloyl-CoA, ADP and Pi. This study is the first report of an ADP-formation by PCSs. In addition to pimelate (9.5 U/mg = 100 %) RaPCS1 converted adipate, phenylacetate, isobutyrate and thioglycolate with more than 30 % of the activity with pimelate. RaPCS2 catalysed the reaction only efficiently with pimelate (11.5 U/mg) and butyrate. Neither RaPCS1 nor RaPCS2 were able to catalyse the reaction with CoA-esters like acetyl-CoA, isobutyryl-CoA or phenylacetyl-CoA, indicating that PCS only participates in acid formation. Two catalytically essential histidine-residues, conserved in all ACDs characterised so far, are also highly conserved in PCSs. Each of the histidine-residues was mutated to alanine by site-directed mutagenesis, causing a complete loss of PCS-activity. The data indicate that both histidine-residues are essential for the activation of pime-late by PCSs. Phylogenetic analyses indicate that PCSs and FCSs form a distinct phylogenetic cluster within the ACD-homologous Acyl-CoA Synthetases. FCS in D. acidovorans. The recombinant FCS formed a 170 kDa homodimere and catalysed the conversion of ferulate, ATP and HSCoA to feruloyl-CoA, ADP and Pi. The enzyme was highly specific for ferulate (Km = 4 µM). In addition to ferulate (12 U/mg = 100 %) the FCS only converted adipate (7 %), butyrate (12 %) and pimelate (4 %) with low efficiency. This is the first report of the characterisation of an ADP-forming FCS so far.

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