Detection of new sequence variants for flowering and bolting time genes in species of the genus Beta

Frerichmann, Sebastian Leo Max

Induced mutations have been used in plant breeding since the early 1960s. The traditional way (forward genetics) for identifying new traits was to analyze phenotypic changes caused by mutations and to link these to a gene. This approach has been complemented by a reverse genetic strategy, in which a gene of interest and its alteration in structure or activity is analyzed for an impact on phenotype. Targeting Induced Local Lesions in Genomes (TILLING) is a reverse genetic technique to identify point mutations in mutant populations, which has been successfully applied for a variety of crop species as a valuable tool for the manipulation of genes underlying traits of agronomic importance. Sugar beet (Beta vulgaris L. ssp. vulgaris var. altissima) is the only crop plant used for sugar production in Europe. Due to the narrow genetic variability of the sugar beet gene pool, the introduction of new traits is of high interest to breeders. The aims of this work were (1) to identify flowering time mutants among EMS treated offspring and (2) to identify natural sequence variants by genotyping (EcoTILLING). In the first part, 20,000 seeds of the doubled haploid (DH) sugar beet line SynDH1 were mutagenized with 1% ethyl methanesulfonat (EMS) and M2 seeds were produced from 837 M1 plants after bag isolation. From 3,418 M2 plants, M3 seed was produced in the greenhouse. A second pre-existing mutant population derived from the annual sugar beet line 930190 was examined as well. This population included 2688 M2-plants, which were obtained from the seed of 1550 M1-plants. DNA samples were taken from all M2 plants and pooled by a two dimensional 8x pooling scheme. A TILLING protocol for sugar beet has been established based on heteroduplex digestion with the restriction endonuclease (CEL I) form celery stalks. The following genes from the sugar beet bolting and flowering time pathway were examined for induced mutations with 19 primer combinations: BTC1, BvCOL1, BvFL1, BvFLK, BvFT1, BvFT2, BvFVE, BvLHP1, BvSWP, and BvTON1. In ten of these genes 72 sequence variants (SV) were found, including 52 (58%) within exon regions. Twenty-four (32%) of the mutations in exon regions were non-synonymous mutations that cause an amino acid exchange. One other mutation was located within a splice site. No nonsense (stop codon) mutation could be found. Sixty-four SVs were transition mutations (G/C A/T) likely to result from EMS mutagenesis. The overall frequency of SVs was 1/816 kb, whereas a transition frequency of 1/1,062 kb could be determined. M3 progenies from of 28 M2 mutants of the genes BTC1, BvFLK, BvFT1, BvLHP1, and BvTON1 were grown in the greenhouse and scored with respect to time to bolting and time to flower. However, no statistically significant effects of the mutations were found. Based on the low mutation frequency and the low phenotypic variation the here presented resource appears to be not suitable for further TILLING screens. In addition, an unexpected high heterogeneity (8.6%) was detected among the non-EMS treated plants of the 930190 population after AFLP analysis of 104 M2 plants. It is likely that this heterogeneity has already existed before EMS treatment, and / or occurred during selfing of M1 plants through cross-pollination. In the second part of this work, natural SVs were identified by the same genotyping technique (referred as EcoTILLING) from 268 accessions in a diversity panel of Beta vulgaris accessions including sugar beet, garden beet (var. conditiva), leaf beet (var. flavescens), and fodder beet (var. crassa) as well as the wild beet (B. vulgaris ssp. maritima, BVM). This diversity panel had already been tested in overwintering field trials with respect to bolting before winter and survival after winter. For both traits, a large variation was determined. With the aim to analyze the population structure of the diversity panel with the software, STRUCTURE an AFLP analysis was carried out. This analysis suggested the presence of three subgroups (k = 3), in which most of the sugar beets accessions were assigned to the first group, while the examined accessions of fodder beet and garden beet were assigned to the second group. The third group comprised primarily of leaf beet and BVM-accessions. EcoTILLING in the three bolting and flowering time genes BTC1, BvFL1, and BvFT1 resulted in the identification of 20 silent SNPs and one non-synonymous SNP, which could be grouped in 55 haplotypes. The haplotypes were tested for an association with bolting before winter (BR), survival rate after winter (SR), and SR with BR as cofactor. The association study revealed that haplotypes for BvFL1 are significantly associated with BR, SR, and SR with BR as cofactor. The data give further evidence that the FLC-like gene may affect flowering time and winter survival in Beta species.

Eigenschaften zu generieren. Dies erforderte bisher meist aufwändige phänotypische Analysen umfassender Mutantenpopulationen, um interessante Mutantenphänotypen zu detektieren. Diese Mutanten dienen zugleich der Identifikation der zugrunde liegenden Gene („forward genetics“). Im Gegensatz dazu erfolgt beim „reverse genetics“-Ansatz zunächst eine Sequenz/Gen-Identifikation mit nachfolgender phänotypischer Analyse. Die Technik des „Targeting Induced Local Lesions in Genomes“ (TILLING) zählt zu den “reverse genetic”-Ansätzen. TILLING ermöglicht die Detektion sowie Identifikation von Punktmutationen in Mutantenpopulationen. In der Pflanzenzüchtung wurde diese Technik bereits erfolgreich eingesetzt, um Mutationen in Genen verschiedener Nutzpflanzen zu finden, welche für wichtige züchterische Eigenschaften kodieren. Die Zuckerrübe (Beta vulgaris L.) ist die einzige Nutzpflanze, welche in Europa zur Zuckergewinnung angebaut wird. Aufgrund der geringen genetischen Variabilität des Zuckerrüben-Genpools ist die Integration neuer Merkmale von besonderem züchterischem Interesse. Ziele dieser Arbeit waren (1) die Identifikation von Blühzeitpunkt-Mutanten in der Nachkommenschaft (M2) einer mit einem chemischen Mutagen (Ethylmethansulfonat, EMS) behandelten Zuckerrüben-Population (TILLING) sowie (2) die Ermittlung natürlicher Sequenzvarianten durch Genotypisierung (EcoTILLING). Im ersten Teil der Arbeit wurden 20.000 Samen der doppelthaploiden (DH) Zuckerrübenlinie SynDH1 mit 1% (EMS) mutagenisiert und von 837 M1-Pflanzen M2-Samen nach Tüten-Isolation produziert. Im Folgenden konnte von 3.418 M2-Pflanzen M3 Saatgut erstellt werden. Weiterhin wurde eine zweite, bereits existierende Mutatenpopulation aus einer annuellen Zuckerrübenlinie (930190) untersucht. Diese M2 Population umfasste 2.688 M2-Pflanzen, welche aus dem Saatgut von 1.550 M1-Pflanzen erhalten wurden. Von allen M2-Pflanzen wurden DNA Proben genommen und in sogenannte zweidimensionale Achtfachpools überführt. Ein TILLING-Protokoll für die Zuckerrübe wurde basierend auf einem Heteroduplex-Restriktionsverdau mit der Endonuklease CEL1 aus Stangensellerie etabliert. Die folgenden Gene aus dem Schoss- und Blüh-Signalweg der Zuckerrübe wurden hinsichtlich induzierter Mutationen mit 19 Primerkombinationen untersucht: BTC1, BvCOL1, BvFL1, BvFLK, BvFT1, BvFT2, BvFVE, BvLHP1, BvSWP, und BvTON1. In zehn dieser Gene konnten insgesamt 72 Sequenzvarianten (SV) gefunden werden, darunter 52 (67%) in Exon-Regionen. Vierundzwanzig (32%) der Mutationen in Exon-Regionen waren nicht-synonyme Mutationen, welche einen Aminosäure-Austausch bewirken. Eine weitere Mutation befand sich innerhalb einer Spleißstelle. Es konnte keine nonsense Mutationen gefunden werden. 64 SVs wiesen eine Transition (G/C  A/T) auf, welche eine Folge der EMS-Behandlung darstellt. Die Frequenz aller 72 SV betrug 1/816 kb, wohingegen eine Transitionsfrequenz von1/1.062 kb ermittelt wurde. M3 Nachkommen von 28 M2 Mutanten der Gene BTC1, BvFLK, BvFT1, BvLHP1 und BvTON1 wurden im Gewächshaus angebaut und hinsichtlich ihres Schoss- und Blühzeitpunktes bonitiert. Es konnten jedoch keine statistisch signifikanten Effekte der Mutationen gefunden werden. Aufgrund der geringen Mutationsrate und der geringen phänotypischen Variation scheint die hier vorgestellte Ressource nicht für weitere TILLING Untersuchungen geeignet zu sein. Darüber hinaus wurde mit Hilfe einer AFLP-Analyse von 104 M2 Pflanzen der Populationen 930190 eine unerwartet hohe Heterogenität (8,6%) der nicht mit EMS behandelten Pflanzen gefunden. Es ist anzunehmen, dass diese Heterogenität bereits vor der EMS Behandlung vorhanden war und/oder dass Fremdbestäubung während der Selbstbefruchtung der M1 Pflanzen die Ursache dafür ist. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden natürliche SVs mit dem gleichen methodischen Ansatz (als sogenanntes EcoTILLING) in einem Diversitäts-Sortiment von 268 Beta vulgaris Akzessionen identifiziert. Dieses Sortiment umfasste die Kulturformen Zuckerrübe, Rote Bete (var. conditiva), Mangold (var. flavescens) und Futterrübe (var. crassa) sowie die Wildrübe (B. vulgaris subsp. maritima L., BVM) und war bereits zuvor in Überwinterungsfeldversuchen hinsichtlich des Schossverhaltens vor dem Winter und der Überlebensrate nach dem Winter untersucht worden. Für beide Merkmale wurde eine große Variation ermittelt. Mit dem Ziel der Erfassung der Populationsstruktur des Sortiments mit der Software-STRUCTURE wurde eine AFLP-Analyse durchgeführt. Es konnten drei Untergruppen (k = 3) detektiert werden, welche in der ersten Gruppe hauptsächlich Vertreter der Zuckerrüben-Akzessionen aufwies, während die untersuchten Akzessionen von Futterrüben und Roter Bete der zweiten Gruppe zugeordnet wurden. Die dritte Gruppe enthielt vorrangig Mangold und BVM-Akzessionen. Das hier durchgeführte EcoTILLING in den drei Schoss- und Blühzeitpunkt-Genen BTC1, BvFL1 und BvFT1 führte zur Identifikation von 20 synonymen Einzelnukleotid-Polymorphismen (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) sowie einem nicht-synonymen SNP, welche in 55 Haplotypen gruppiert wurden. Eine Assoziation mit den Parametern Schossrate, Überlebensrate, Überlebensrate in Abhängigkeit von Schossrate als Co-Faktor konnte für die untersuchten BvFL1 Haplotypen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse liefern weitere Hinweise darauf, dass das FLC-ähnliche Gen eventuell die Blühzeit und auch die Winterhärte in Beta Arten beeinflusst.

Cite

Citation style:

Frerichmann, Sebastian: Detection of new sequence variants for flowering and bolting time genes in species of the genus Beta. 2013.

Rights

Use and reproduction:
No CC License (german copyright law applies)

Export