Untersuchungen zu genetischen Variationen im mARC-haltigen N-reduktiven Enzymsystem

Ott, Gudrun

Das mARC-haltige N-reduktive Enzymsystem besteht aus mARC-, Cytochrom b5 Typ B und NADH Cytochrom b5 Reduktase und ist in der Lage, N-hydroxylierte Verbindungen in Gegenwart von NADH zu reduzieren. Ziel dieser Arbeit war es, 12 zum Aminosäureaustausch führende SNPs in diesem Enzymsystem zu untersuchen. Vier SNPs in MARC1 (c.493A>G, c.560T>A, c.736T>A und c.739G>C) und zwei SNPs in MARC2 (c.730G>A und c.735T>G) wurden mittels Pyrosequencing genotypisiert. Sie wiesen insgesamt nur eine geringe Frequenzhäufigkeit in der untersuchten Kohorte von 340 gesunden Kaukasiern auf. Nur für einen SNP in MARC1 (c.493A>G) konnte die homozygote Variante mit einer Frequenz von 7,1% detektiert weden. Dieser SNP führte zur Proteinvariante A165T. Die Proteinvarianten von mARC (mARC-1: V96L, A165T, M187K, C246S, D247H und M268I; mARC-2: G244S und C245W) und Cytochrom b5 Typ B (S2F, D14G, K16E und T22A) wurden in E. coli exprimiert und mittels in vitro Biotransformations-studien am Substrat Benzamidoxim, dem Modellsubstrat der Amidoximprodrugs, untersucht. Die katalytische Effizienz der Varianten G244S und C245W war im Vergleich zu ihrem Wildtypprotein signifikant erniedrigt, ebenso die des mARC-2-Wildtypproteins im Vergleich zum mARC-1-Wildtypprotein. Die mARC-1-Variante A165T und alle Cytochrom b5 Typ B-Varianten beeinflussten die N-reduktive Aktivität des Enzymsystems nicht. Die mARC-1-Mehrfachvariante, in der alle sechs Aminosäuren (V96L, A165T, M187K, C246S, D247H und M268I) ausgetauscht waren, zeigte trotz Bindung des Molybdäncofaktors nahezu keine N-reduktive Aktivität mehr. Dies könnte ein erster Hinweis auf mögliche Substratbindestellen sein. Polymorphismen können zu Arzneimittelnebenwirkungen führen. Die Beteiligung des N-reduktiven Enzymsystems an der Reduktion von Sulfamethoxazolhydroxylamin wurde in vitro gezeigt. Die mARC- und Cytochrom b5 Typ B-Proteinvarianten beeinflussten die Reduktion nicht, so dass eine Beteiligung an der Pathogenese der Hypersensitivitätsnebenwirkung unter Sulfamethoxazol sehr unwahrscheinlich ist. mARC-1 besaß die höhere katalytische Effizienz in der Reduktion von Benzamidoxim und mARC-2 in der Reduktion von Sulfamethoxazolhydroxylamin. Erste Versuche zur Etablierung eines Biomarkertests zu einer Nebenwirkung des Amidoxim-Prodrugs Ximelagatran, die von der Firma caprotecTM bioanalytics GmbH durchgeführt wurden, zeigten eine Wechselwirkung zwischen der Melagatran Capture Compound und dem mit dem löslichen HLA-Molekül DRB1*0701.

Mitochondrial amidoxime reducing component (mARC), cytochrome b5 type B and NADH cytochrome b5 reductase form an N-reductive enzyme system that is capable of reducing N-hydroxylated compounds in the presence of NADH. Aim of this work was to investigate 12 nonsynonymous SNPs located in this enzyme system. Genotype frequencies of four SNPs in MARC1 (c.493A>G, c.560T>A, c.736T>A and c.739G>C) and two in MARC2 (c.730G>A and c.735T>G) were investigated by pyrosequencing. The six variants were of low frequency in a cohort of 340 healthy Caucasian. Only one homozygous variant (493AA, MARC1) was detected with a frequency of 7.1% leading to the protein variant A165T. Protein variants of mARC (mARC-1: V96L, A165T, M187K, C246S, D247H and M268I; mARC-2: G244S and C245W) and cytochrome b5 type B (S2F, D14G, K16E and T22A) were expressed in E. coli. In vitro biotransformation studies were performed with benzamidoxime, the model compound for amidoxime prodrugs. Catalytic efficiencies of mARC-2 variants G244S and C245W were significantly decreased compared with their wild type protein. Catalytic efficiency of mARC-1 wild type protein was significantly decreased compared with mARC-2 wild type protein. mARC-1 variant A165T and cytochrome b5 type B variants S2F, D14G, K16E and T22A did not influence the N-reductive activity. After replacement of all six amino acids (V96L, A165T, M187K, C246S, D247H and M268I) in one mARC-1 protein N-reductive activity was almost absent. Possibly these residues are important for substrate binding altogether. Genetic polymorphisms are able to cause adverse drug reactions. Participation of the N-reductive enzyme system in the reduction of sulfamethoxazole hydroxylamine was demonstrated in vitro. Protein variants of mARC and cytochrome b5 type B did not influence this N-reduction and most likely would not participate in the pathogenesis of hypersensitivity reactions after treatment with sulfamethoxazole. When catalytic efficiencies for both substrates were compared, mARC-1 seemed to be more efficient in the N-reduction of benzamidoxime. mARC-2 was more efficient in the N-reduction of sulfamethoxazole hydroxylamine. Initial experiments focusing on the establishment of a biomarker test that might be able to detect patients at risk of adverse reactions after treatment with ximelagatran were performed by the company caprotecTM bioanalytics GmbH in Berlin. A first interaction between a melagatran capture compound and the soluble MHC class II molecule DRB1*0701 was shown.

Cite

Citation style:

Ott, Gudrun: Untersuchungen zu genetischen Variationen im mARC-haltigen N-reduktiven Enzymsystem. 2013.

Rights

Use and reproduction:
No CC License (german copyright law applies)

Export