Die molekulare Basis des antimikrobiellen Systems von Dictyostelium discoideum

Bitzhenner, Moritz

Die soziale Amöbe Dictyostelium discoideum lebt als ursprünglicher Phagozyt im Waldboden, wo sie sich von Bakterien ernährt. Bei Nahrungsknappheit aggregieren die Amöben und durchlaufen einen Entwicklungszyklus, an dessen Ende ein Fruchtkörper mit Dauerstadien steht. Das einzige bisher charakterisierte antimikrobielle Effektormolekül ist das Amöbenlysozym AlyA (Müller et al., 2005). Im Genom der Amöbe sind jedoch 33 Amoebapore-like peptides (Apls) mit jeweils einer SAPLIP-Domäne und 14 Lysozyme kodiert, die beim Abtöten der internalisierten Bakterien beteiligt sein können. In dieser Arbeit wurden weitere antimikrobielle Proteine untersucht. Die Lysozyme DdLysEh1 – 3 und Apl B2 wurden als Protein in axenisch kultivierten Amöben nachgewiesen. Offenbar ist dazu Apl B2 proteolytisch aus einem Vorläuferprotein mit mehreren SAPLIP-Domänen herausgeschnitten worden. Des Weiteren wurden das Lysozym AlyC und die Apls E1, E2 und D in Dictyostelium-slugs, einem mobilen Stadium im Entwicklungszyklus, identifiziert. Für eine funktionale Analyse der Apls wurden die anionischen Proteine Apl B2 und Apl D rekombinant in einem prokaryotischen System hergestellt und gereinigt. Für rApl D wurde die Sekundärstruktur untersucht und die Tertiärstruktur modelliert. Das Protein wies mit 78,7 % hohe Anteile an α-helikalen Strukturelementen auf. Die modellierte Tertiärstruktur ähnelte der Struktur von Saposin A und zeigte die für SAPLIP-Proteine charakteristische Faltung eines globulären Proteins mit vier α-Helices und drei intramolekularen Disulfidbrücken. Die Proteine rApl B2 und rApl D zeigten im Mikrosuszeptibilitätstest keine antimikrobielle Aktivität gegen Escherichia coli oder Bacillus megaterium, wobei die maximal eingesetzte Proteinkonzentration für rApl B2 bei 5 μM und rApl D bei 50 μM lag. Allerdings permeabilisierten beide Proteine die Membran der gram-positiven B. megaterium-Bakterien bei leicht azidischen pH-Werten. Die Membranen der gram-negativen Bakterien E. coli und verschiedener Klebsiella pneumoniae-Stämme sowie der Hefe Saccharomyces cerevisiae und D. discoideum selbst wurden nicht permeabilisiert. Beide Proteine zeigten bei niedrigen pH-Werten eindeutige porenbildende Aktivität gegen Liposomen, wobei die Aktivität von rApl D an eine korrekte Faltung geknüpft war. Damit sind die beiden Proteine rApl B2 und rApl D neben dem Lysozym AlyA die einzigen in Dictyostelium discoideum charakterisierten antimikrobiellen Effektormoleküle und führen zu einem besseren Verständnis der intrazellulären Vorgänge beim Abtöten internalisierter Mikroorganismen.

As a soil-dwelling phagocyte the social amoeba Dictyostelium discoideum thrives on internalised bacteria. Upon depletion of microbial food resources the amoebae aggregate and undergo various stages of a developmental cycle resulting in a fruiting body with amoeba cysts. The only antimicrobial protein characterised so far is the amoeba lysozyme AlyA (Müller et al., 2005). Genome analysis revealed a multifarious family of 33 potential amoebapore-like peptides (Apls) with a SAPLIP-domain each. Additionally, the genome harbours genes potentially coding for 14 lysozymes, which all may be involved in the killing of internalised microorganisms. Within this thesis further antimicrobial proteins were characterised. The lysozymes DdLysEh1 – 3 and Apl B2 were identified in protein extracts from axenically cultivated amoebae. Apparently, Apl B2 has been released from a multi-domain precursor molecule. Additionally, the lysozyme AlyC and the Apls E1, E2 and D were identified in Dictyostelium slugs, a mobile stage of the developmental cycle. To access the protein function the anionic proteins Apl B2 and Apl D were recombinantly expressed in a prokaryotic system and purified. The secondary structure of Apl D was analysed and its tertiary structure modelled. Apl D showed a high percentage of α-helical elements (78,7 %). The tertiary structure of rApl D was similar to Saposin A and showed the characteristic SALIP fold of a globular protein with four α-helices and three intramolecular disulphide bridges. The proteins rApl B2 and rApl D displayed no antimicrobial activity against Escherichia coli or Bacillus megaterium at a maximum concentration of 5 μM for rApl B2 and 50 μM for rApl D. The proteins permeabilised the membrane of the gram-positive bacterium B. megaterium. The membrane integrity of the gram-negative bacteria E. coli, various Klebsiella pneumoniae-strains and the yeast Saccharomyces cerevisiae as well as D. discoideum itself was unaltered. Both proteins revealed potent pore-forming activity against liposomes at slightly acidic pH values. The activity of rApl D relies on a correct folding of the protein. Together with AlyA the proteins rApl B2 and rApl D are the only antimicrobial molecules in Dictyostelium discoideum known so far and the findings will lead to a better understanding of the intracellular killing of microorganisms.

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Bitzhenner, Moritz: Die molekulare Basis des antimikrobiellen Systems von Dictyostelium discoideum. 2013.

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