Sea urchin membrane transport mechanisms for calcificationand pH homeostasis

Holtmann, Wiebke Catharina

Larval sea urchins serve as a model organism for calcification and adult individuals are a keystone species in marine shelf ecosystems. Both life stages will presumably be affected by alterations of seawater pCO2 and the accompanying change in pH, [HCO3-] and [CO32-]. This change in seawater carbonate chemistry is known as ocean acidification and is based on anthropogenically caused increase in pCO2 by burning fossil fuels and deforestation. Ocean acidification is thought to affect marine organisms in terms of acid-base regulation but also in terms of calcification, somatic growth and reproductivity. To understand the impact of ocean acidification on calcification processes a profound knowledge of the underlying cellular mechanisms is needed. This thesis is split into two main topics: cellular mechanisms involved in sea urchin larval calcification, and ocean acidification related effects on skeletal elements and mechanisms for acid-base regulation of the perivisceral coelomic fluid (PCF) in adult sea urchins. To understand more about the cellular mechanisms involved in sea urchin calcification, larvae of Strongylocentrotus droebachiensis were raised in the presence of different ion transport protein inhibitors and the primary body rod length of pluteus larvae was taken as a measure for calcification. This investigation challenged the current cell model of sea urchin ion transport. The model had been developed on the basis of high drug concentrations which partially resulted in toxic side effects on larval development. The inhibitors used in this study targeted the Na+K+2Cl- cotransporter (NKCC), L-type Ca2+ channel, Ca2+ ATPase, anion exchangers (SLC4-family), H+K+ ATPase and V-ATPase. I could show that loop diuretics inhibited calcification selectively and could prove that NKCC is expressed in sea urchin larvae. In addition, the function of the cotransporter in the primary mesenchyme cells (PMCs) was addressed and it could be shown that this transporter is needed for maintaining the cytoplasmic cord, i.e. the part of the PMCs which sheaths the larval spicule. In contrast, the other drugs caused toxic side effects in whole larvae assays. This questions any published interpretation concerning the direct involvement of the respective transport proteins in calcification mechanisms. It has recently been shown that adult S. droebachiensis can regulate its pH of PCF by increasing [HCO3-] during long-term exposure to elevated CO2 (6 weeks, 102 and 284 Pa). The underlying mechanisms are still unknown. However, stereom dissolution and active HCO3- reabsorption mechanisms via the intestine are two possible distinct hypotheses. I investigated the epithelia which are covering the PCF space for their putative role in barrier and transport function. The peritoneal epithelium, an epithelial barrier between the stereom and the PCF, was shown to be rather leaky for ions. This favours the direct contact of the stereom to any PCF acid-base condition. The intestine exhibited low transepithelial resistance and a relative cation selectivity. It was found to be tight for HCO3- suggesting a contribution to acid-base regulation of PCF by representing a diffusion barrier against the loss of HCO3- from PCF into the intestine. During acute-exposure to hypercapnic conditions (< 4 days) the corrosive character of the PCF resulted in minor dissolution events which led to a partial increase in [HCO3-]PCF. Long-term exposure (6 weeks) did not cause any further ossicle dissolution but daily ossicle growth was reduced. In contrast to the ossicles, primary spines were severely affected by the long-term hypercapnic exposure resulting in destabilisation and dissolution.

Seeigellarven dienen als Modelorganismus zur Erforschung von Kalzifizierungsprozessen, adulte Seeigel sind eine Schlüsselart in marinen Schelf-Ökosystemen. Es ist anzunehmen, dass Seeigel in der Zukunft durch pCO2 Änderungen im Seewasser und die damit einhergehenden Änderungen in pH, [HCO3-] und [CO32-] beeinflusst werden. Diese Änderung in der Karbonatchemie ist bekannt als Ozeanversauerung, ausgelöst durch das Verbrennen von fossilen Brennstoffen und Abholzung. Beide anthropogenen Tätigkeiten führen zu einem Anstieg in atmosphärischem CO2, das wiederrum mit dem Ozean im Equilibrium steht. Es wird angenommen, dass Ozeanversauerung marine Organismen auf verschiedenen Ebenen beeinflusst: zum einem in der Säure-Base Regulation, aber auch in der Kalzifizierung, dem Wachstum und der Fortpflanzung. Um den Einfluss von Ozeanversauerung auf Kalzifizierung zu verstehen ist es notwendig, fundierte Kenntnisse über die der Kalzifizierung zugrunde liegenden Mechanismen zu erlangen. Die vorliegende Arbeit ist in zwei Themenfelder aufgeteilt. Zum einen wurden die Mechanismen, die an der Kalzifizierung von Seeigellarven beteiligt sind, untersucht. Zum anderen wurden in adulten Seeigeln Mechanismen zur Säure-Base Regulation der Coleomflüssigkeit (PCF) und Effekte der Ozeanversauerung auf adulten Skelettanteile untersucht. Um die zellulären Mechanismen der Larvenkalzifizierung zu untersuchen, wurden Larven des Seeigels Strongylocentrotus droebachiensis unter Inhibitoren verschiedener ionaler Transportproteine wachsen gelassen. Die Länge des „primary body rods“ wurde als Maß für die Kalzifizierung genommen. Durch diese Untersuchung wurde das aktuell gültige Zellmodel des Ionentransportes zur Kalzifizierung in Seeigellarven überprüft. Dieses Model wurde aus Studien, die hohe Inhibitorenkonzentrationen verwendet haben und teilweise toxische Nebeneffekte berichtet haben, entwickelt. Die in der vorliegenden Studie verwendeten Inhibitoren blockieren Na+K+2Cl- Kotransporter (NKCC), L-type Ca2+ Kanal, Ca2+ ATPase, Anionenaustauscher (SLC4-family), H+K+ ATPase und V-ATPase. Es konnte gezeigt werden, dass die verwendeten Schleifendiuretika selektiv die Kalzifizierung inhibiert haben. Zudem konnte die Expression von NKCC in Seeigellarven durch RT-PCR bestätigt werden und es wurde gezeigt, dass NKCC notwendig ist, um die „cytoplasmic cords“, PMC-Membranausläufer, die die Kalknadeln ummanteln, aufrechtzuerhalten. Alle anderen Inhibitoren haben trotz gering eingesetzter Konzentrationen toxische Artefakte auf Entwicklung und Larvenvitalität hervorgerufen. Dies stellt die publizierten Interpretationen über die direkte Beteiligung der jeweiligen Transportproteine innerhalb der Kalzifizierung in Frage. Vor kurzem konnte gezeigt werden, dass adulte S. droebachiensis, die in einem Langzeitexperiment erhöhten CO2 ausgesetzt waren (6 Wochen, 102 und 284 Pa), den pH der PCF durch einen Anstieg in [HCO3¬-] regulieren können. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind unbekannt; die Auflösung des Stereoms oder eine aktive HCO3- Reabsorption durch den Darm stellen mögliche Kompensations-mechanismen dar. Die Epithelien, die in Kontakt mit der PCF stehen, wurden auf ihre mögliche Rolle als Barriere oder transportierendes Epithel hin untersucht. Das peritoneale Epithel, welches das Stereom vom PCF trennt, zeigte eine hohe ionale Durchlässigkeit. Dadurch ist es wahrscheinlich, dass das Stereom jeder Säure-Base Änderungen der PCF ebenfalls ausgesetzt ist. Der Darm entwickelte einen geringen transepithelialen Widerstand und eine relative Kationenselektivität. Obwohl der geringe Widerstand das Gewebe als ionendurchlässig charakterisiert, konnte eine HCO3--Barrierefunktion gezeigt werden. Durch diese Barriere kann ein HCO3- Verlust über den Darm verhindert werden und das Gewebe kann somit zur Säure-Base Regulation der PCF beitragen. Während kurzeitigen hyperkapnischen Bedingungen (< 4 Tage) waren die Ossikel korrosiven Bedingungen der PCF ausgesetzt, was wiederrum in leichten Auflösungen der Ossikel resultierte. In Langzeitexperimenten (6 Wochen) führte die Regulation der PCF dazu, dass keine weiteren Auflösungen eintraten; die Wachstumsrate der Ossikel wurde jedoch unter hyperkapnischen Bedingungen reduziert. Im Gegensatz zu den Ossikeln wurden die primären Stacheln durch anhaltende erhöhte pCO2 Werte (6 Wochen) in ihrer Stabilisation beeinträchtigt und wiesen Auflöseerscheinungen auf.

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Holtmann, Wiebke: Sea urchin membrane transport mechanisms for calcificationand pH homeostasis. 2013.

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