"Next Generation Sequencing" basierte Prozessentwicklung zur systematischen Patientengenomanalyse am Beispiel der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

May, Sandra

Die Entdeckung von SNPs, die mit komplexen Krankheiten assoziiert sind, sind in der Aufklärung der genetischen Prädisposition wichtige Meilensteine und führten zu einem neuen Krankheitsverständnis. Da sie aber nur einen Teil des genetischen Risikos erklären, ist man weiterhin auf der Suche nach kausativen Varianten, die die „fehlende Heritabilität“ erklären sollen. Stark vorangetrieben wird diese sowohl genomweite- als auch Loci-gezielte Mutationssuche durch neue technische Möglichkeiten wie „Next Generation Sequencing“. Die vorliegende Arbeit bestand aus zwei Teilprojekten, an die jeweils die Etablierung der SOLiD- Sequenzierung für den jeweiligen Anwendungsbereich geknüpft war. Das erste Teilprojekt befasste sich mit der Auflösung von durch GWAS identifizierte Risikoloci bis auf Einzelbasenniveau mit dem Ziel bisher unbekannte Varianten zu detektieren. In einem aufwendigen Verfahren wurden die anvisierten Ziel-Regionen in jeweils 56 Individuen über LR-PCR angereichert um in einem späteren Schritt mit Hilfe der SOLiD- Technologie sequenziert zu werden. Für Analysen, die über die SNP-Detektion hinausgingen, wurde sich im folgenden auf die CED-Loci NOD2, IL23R, ATG16L1, IL10, NKX2-3, STAT3 und IRGM beschränkt. In einer Assoziations-Genotypisierungsstudie wurden in einem ersten Verfahren 88 SNPs, die in der Sequenzierung detektiert wurden, in 364 Morbus Crohn Patienten und 368 gesunden Kontrollen genotypisiert. In einem zweiten Ansatz wurden aus diesem ersten Experiment 26 SNPs erneut in einer größeren Studienpopulation (2800 Kontrollen, 2500 Fälle) genotypisiert. Eine bisher unbekannte Variante in dem mit Morbus Crohn assoziierten Gen NOD2 ist in den Fällen mit einer Allelfrequenz von 0,0019 genotypisiert wurden. In den Kontrollen trat diese Variante nicht Erscheinung. Diese Variante ist ein hochinteressanter Kandidat für eine sehr seltene Mutation, die mit dem Phänotyp Morbus Crohn assoziiert sein könnte. Sie wird Gegenstand weiterer Untersuchungen sein. Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein vollständiges Genom einer an Morbus Crohn erkrankten Patientin ebenfalls mittels SOLiD-Technologie sequenziert. Das Genom konnte annährend vollständig mit einer sehr guten Coverage sequenziert werden. Die Validierung mittels etablierter Sanger-Technologie zeigte, dass die SNP-Detektion robust, in der Identifizierung bisher unbekannter Varianten aber mit Schwächen behaftet ist. Der genetische Hintergrund der erkrankten Person konnte gut charakterisiert werden. Dabei stellte sich heraus, dass in dem Genom der sequenzierten Patientin nicht überdurchschnittlich viele SNPs mit potentiell schädigender Wirkung angereichert sind. Vielmehr ähnelt es „gesunden“ Genomen. Es konnten über drei Millionen SNPs detektiert werden. Es wurden Varianten identifiziert, die schon mit dem Phänotyp Morbus Crohn assoziiert sind, und so einen Teil des Krankheitsbildes erklären. Unter anderem wurde die sehr seltene Deletion vor dem Gen IRGM in der Patientin homozygot identifiziert. Eine bestehende Infektion mit Mycobacterien konnte ebenfalls mit der genetischen Konstitution in Verbindung gebracht werden. Das Identifizieren von neuen Varianten, die die weitere Aufklärung der Ätiologie des Morbus Crohn vorantreiben, gestaltet sich u. a. aufgrund fehlender Vorhersageprogramme für nicht-kodierende Varianten und nicht zuletzt durch die Komplexität der Krankheit und der Interaktion mit nicht berechenbaren nicht-genetischen Ursachen weiterhin als schwierig.

The identification of an impressive number of disease-associated single nucleotide polymorphisms in the last years represents a milestone in the dissection of genetic predisposition and has led to new insights into disease etiology. However, as only a small part of the disease heritability can be explained by these polymorphisms, the search for causative variants is still ongoing in order to explain the “missing heritability”. “Next Generation Sequencing” is an appropriate tool to detect rare and potentially causative variants in whole genome seqencing approches or in target resequencing studies. This thesis consisted of two subprojects, both of which involved the establishment of SOLiD „Next Generation Sequencing“-technology according to its special application. The first project aimed at in depth-sequencing of ten riskloci identified in genome-wide association studies for several phenotypes (IBD, sarcodosis, psoriasis, PSC) in order to detect unknown variations. In an elaborate procedure the target regions were enricht by LR-PCR in 56 individuals for subsequent sequencing with the SOLiD „Next Generation Sequencing“-technology. SNP-calling was performed for all loci. For further analysis beyond SNP detection this study concentrated on the IBD loci NOD2, IL23R, ATG16L1, IL10, NKX2-3, STAT3 and IRGM. In the first follow-up case/control association study 88 potential SNPs detected by sequencing were genotyped in 364 German Crohn`s disease patients and 368 healthy German controls. In a second approach 26 SNPs from the first association study were genotyped in a large independent study population (2800 German controls, 2500 German cases). A novel variation with an allele frequency of 0,0019 in the cases could be identified in the Crohn`s disease risk gene NOD2. Since this variation was not found in the controls, it represents a very promising candidate for association with Crohn`s disease will be tested in further investigations. In the second part of this thesis whole genome sequencing of a female Crohn`s disease patient with SOLiD „Next Generation Sequencing“-Technology was performed. The whole genome was sequenced with a satisfactorily coverage. The validation of identified polymorphisms with Sanger-Sequencing technology revealed a robust SNP detection, but shows some weakness in the de-novo identification of unknown variants. However, the genetic background of the patient was comprehensively characterized. It was shown that potentially damaging SNPs are not enriched in this genome, resembling a „healthy“ genome. A total of more than three million SNPs were detected, including established Crohn`s disease risk variations, which explain part of the phenotypic variation. Amongst others the patient revealed to be a homozygous carrier of the rare deletion upstream of the IRGM. A present infection with Mycobacterium paratuberculosis could be connected to the genetic background of the patient.

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May, Sandra: "Next Generation Sequencing" basierte Prozessentwicklung zur systematischen Patientengenomanalyse am Beispiel der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen. 2013.

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