Genomweite Annotation von Translationsinitiationsstellen in der humanen Monozyten-Zelllinie THP-1

Fritsch, Claudia

In der vorliegenden Arbeit wurde die erste genomweite Annotation von Translationsinitiationsstellen (TISs) in einer humanen Zelllinie durchgeführt. Insgesamt wurden 7251 TISs in 5062 Transkripten, welche die definierten Analysekriterien erfüllten, detektiert. Die Identifizierung von TISs basierte bis vor einiger Zeit hauptsächlich auf bioinformatischen Analysen, wobei alternative non-AUG Startstellen nicht erfasst wurden. Zahlreiche Studien dokumentieren, dass die Translation nicht nur an der kanonischen CDS sondern auch an alternativen AUG und non-AUG Startcodonen in der 5´-UTR der Transkripte initiiert. Diese upstream lokalisierten Translationsinitiationsstellen repräsentieren Upstream-open-Reading-Frames (uORFs) und CDS überlappende uORFs (ovuORFs), die entscheidende regulatorische Funktionen für die Genexpression haben können, sowie N-terminale Proteinextensionen, welche für die subzelluläre Proteinsortierung maßgeblich sein können. Infolge einer funktionellen Klassifizierung der 7251 vorhergesagten TISs wurden 2305 kanonische Starts, 2994 neue uORFs, 1406 neue ovuORFs und 546 neue N-terminale Proteinextensionen dokumentiert. Als Voraussetzung für eine erfolgreiche Durchführung musste zunächst das Ribosomen-Profiling etabliert werden, das auf der Sequenzierung von durch Ribosomen geschützten ca. 30 nt langen mRNA-Fragmenten basiert. Die akkurate Identifizierung der Startstellen erfolgte anschließend durch die Behandlung der Zellen mit Puromycin und Cycloheximid, wodurch die Ribosomen an den TISs der Transkripte angereichert wurden. Mit Hilfe eines künstlichen neuronalen Netzes, das mit ribosomalen Footprints an zuvor annotierten AUG Startstellen trainiert wurde, wurden die TISs daraufhin systematisch annotiert. Um die Qualität der Methode und die Zuverlässigkeit der Ergebnisse dieser Arbeit zu validieren, wurden die hier bestimmten TISs mit zuvor in der Literatur beschriebenen alternativen non-AUG Startstellen und uORFs verglichen. Letztendlich wurde die Konservierung der Translationsinitiationscodonen (TICs) analysiert. Sowohl AUG- als auch non-AUG-Startcodonen sind zwischen Primaten und zwischen Menschen und Nagetieren stark konserviert. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit verdeutlicht, wie unerwartet oft die Translation an alternativen TISs initiiert und wie komplex und relevant demzufolge die translationale Regulation für die Genexpression ist.

In the present study, the first genome-wide annotation of translation initiation sites (TISs) was performed in a human cell line. In total 7251 TISs were predicted in 5062 transcripts that met the defined analysis criteria. Until recently the identification of TISs was mainly based on bioinformatic analyzes, and alternative non-AUG starts were not be recorded. Numerous studies document that translation not only initiates at the canonical CDS, but also from alternative AUG and non-AUG start codons in the 5' UTR of the transcripts. These upstream localized translation initiation sites represent upstream open reading frames (uORFs) and CDS overlapping uORFs (ovuORFs), that can have critical regulatory functions for gene expression, as well as N-terminal protein extensions, which may be relevant for the subcellular protein sorting. Based on a functional classification of the 7251 predicted TISs, 2305 canonical starts, 2994 new uORFs, 1406 new ovuORFs and 546 new N-terminal protein extensions were documented. As a prerequisite for the successful performance, the ribosome profiling method, based on deep sequencing of ribosome protected mRNA fragments, had to be established. For accurate identification of the start sites, ribosomes were enriched at TISs of the transcripts by adding puromycin and cycloheximide to the cells. TISs were subsequently annotated systematically using a neural network, which was trained on the ribosomal footprints observed at previously annotated AUG start sites. In order to validate the quality of the method and the reliability of the results of this work, the predicted TISs were compared with alternative non-AUG start sites and uORFs, which were previously described in the literature. Following that, the conservation of translation initiation codons (TICs) was analyzed. Both the predicted AUG and non-AUG start codons are highly conserved among primates and between humans and rodents. In summary, it was possible to illustrate in this work, how unexpectedly often translation initiates at alternative TISs and how complex and consequently translational regulation is for gene expression.

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Fritsch, Claudia: Genomweite Annotation von Translationsinitiationsstellen in der humanen Monozyten-Zelllinie THP-1. 2013.

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