Regulation des Methioninzyklus durch die Polyaminbiosynthese und den Ethylensignalweg in Arabidopsis thaliana

Oppermann, Yasmin

Im Methioninzyklus wird Methylthioadenosin (MTA), das Nebenprodukt der Polyamin-, Ethylen- und Nicotianaminbiosynthese, zu Methionin recycelt. In dieser Arbeit wurden zum Einen mögliche Regulationen des Methioninzyklus durch die Polyaminbiosynthese in Arabidopsis thaliana untersucht. Arabidopsis besitzt zwei Gene für die MTA-Nukleosidase (MTN; At4g38800, At4g34840), welche den Eingangsschritt des Methioninzyklus katalysiert. T-DNA-Insertionsmutanten von MTN1 zeigten bei Anzucht auf MTA als Schwefelquelle ein stark reduziertes Wachstum. mtn1-1/mtn2-1 Doppelmutanten besaßen eine verlängerte vegetative Wachstumsphase und waren steril. Es wurde bereits gezeigt, dass Spermidin in der Lage ist das reduzierte Keimlingswachstum und die Infertilität der Doppelmutante zu komplementieren. In dieser Arbeit konnte das reduzierte Wurzelwachstum der mtn1 Mutanten durch Spermin komplementiert werden, obwohl die internen Spermingehalte in den Wurzeln auf MTA als Schwefelquelle erhöht waren. Es ist möglich, dass die Inhibierung von Enzymen durch MTA bei dem reduzierten Wurzelwachstum der mtn1 Mutanten eine Rolle spielt. MTA ist in der Lage Enzyme wie die Spermidin-Synthase in vitro zu inhibieren. Um den Zusammenhang von Wurzelwachstum und Polyaminen weiter zu untersuchen, wurden Loss-of-function-Mutanten verwendet. Mutanten der Spermidin-Synthase (At1g23820, At1g70310), Spermin-Synthase (At5g53120), Thermospermin-Synthase (At5g19530) und zwei Acyl-Transferasen (At2g23510, At2g25150) zeigten keinen, den mtn1 Mutanten ähnlichen Phänotyp. Die Inhibierung dieser Enzyme der Polyaminbiosynthese scheint nicht für das reduzierte Wachstum der mtn1 Mutanten verantwortlich zu sein. Über welche Mechanismen Spermin das Wurzelwachstum verändert ist noch nicht verstanden. In dieser Arbeit wurden außerdem die Regulation des Methioninzyklus durch die Ethylenbiosynthese und den Ethylensignalweg untersucht. Es wurde gezeigt, dass Ethylen zu einer Reduktion der MTN-Aktivität über die Reduktion der MTN1 Proteinmenge führt. Die Reduktion von MTN1 scheint weder transkriptionell noch über den Proteinabbau reguliert zu sein. Analysen der Ethylenmutanten ethylene insensitive2 (ein2), ethylene overproducer3 (eto3) und constitutive triple response1 (ctr1) zeigten, dass die Reduktion der MTN1 Proteinmenge nicht über die Ethylenproduktion, sondern über den Ethylensignalweg reguliert wird. Es wäre denkbar, dass der Ethylensignalweg ein Protein reguliert, welches direkt mit MTN1 interagiert um die Proteinmenge zu reduzieren. Protein Interaktion mit MTN1 wurde bereits für CALCINEURIN B-LIKE3 (CBL3) gezeigt. Diese Interaktion ist Kalzium-abhängig und führt zu einer Reduktion der MTN1-Aktivität. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die Reduktion der MTN-Aktivität durch Ethylen über Kalzium-abhängige Interaktion CBL3 reguliert wird. Kalzium führte zu einer Reduktion der MTN-Aktivität, unabhängig von Ethylen. Kalzium-abhängige Interaktion mit CBL3 ist nicht der Grund für die reduzierte MTN-Aktivität in Anwesenheit von Ethylen. Der genaue Mechanismus zur Regulation von MTN1 über den Ethylensignalweg muss noch weiter analysiert werden.

The Met cycle salvages the reduced sulfur group from methylthioadenosine (MTA) the by-product of polyamine, ethylene and nicotianamine synthesis. In one part of this thesis Arabidopsis thaliana was employed to study regulation of the Met cycle by the polyamine biosynthesis. In Arabidopsis two genes encode MTA nucleosidase (MTN; At4g38800, At4g34840), which catalyzes the first committed step in the Met cycle. T-DNA-Insertion mutants of MTN1 grown on MTA as sulfur source showed severely reduced growth. mtn1-1/mtn2-1 double mutants had a prolonged vegetative stage and were sterile. It was already shown that spermidine complements retarded growth of mtn1 seedlings and infertility of mtn12/mtn2-1 double mutants. In this thesis reduced root growth of mtn1 plants was complemented by spermine, although internal spermine levels were elevated in roots grown on MTA as sulfur source. It is possible that enzyme inhibition by MTA plays a role in reduced root growth of mtn1. MTA is able to inhibit enzymes like spermidine synthase in vitro. To further study root growth in relation to polyamines, loss-of-function mutants were employed. Mutants of spermidine synthase (At1g23820, At1g70310), spermine synthase (At5g53120), thermospermine synthase (At5g19530) and two acyl transferases (At2g23510, At2g25150) did not have a phenotype comparable to mtn1 grown on MTA. Disrupting activity of these enzymes does not seem to be responsible for reduced mtn1 growth. It is not yet understood how spermine affects root growth of mtn1 mutants. Furthermore this study was employed to analyze regulation of the Met cycle by the ethylene biosynthesis and the ethylene signaling pathway. In this thesis it was shown that ethylene leads to a reduction of MTN activity by reducing the abundance of MTN1 protein. Neither changes in MTN transcripts nor changes in protein degradation were responsible for reduced MTN1 protein abundance. Studying the ethylene mutants ethylene insensitive2 (ein2), ethylene overproducer3 (eto3) and constitutive triple response1 (ctr1) pointed to the ethylene signaling rather than ethylene synthesis as a cause for MTN1 reduction. It is possible that ethylene signaling regulates a protein which interacts with MTN1 to reduce protein abundance. Protein interaction with MTN1 was shown for CALCINEURIN B-LIKE3 (CBL3). It is a calcium-dependent interaction and leads to reduced MTN1 activity. The probability of calcium-dependent interaction with CBL3 as the cause of ethylene-induced reduction of MTN activity was analyzed. Calcium led to a reduction of MTN activity independent of the presence of ethylene. Calcium-dependent interaction with CBL3 is hence not the cause for reduced MTN-activity in the presence of ethylene. Further studies will have to be done to reveal the mechanism of regulation.

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Oppermann, Yasmin: Regulation des Methioninzyklus durch die Polyaminbiosynthese und den Ethylensignalweg in Arabidopsis thaliana. 2013.

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