Entwicklung von Strategien zur Dimerisierung von Single-Domain Antikörpern (Nanobodies) sowie zu ihrer Produktion in transgenen Pflanzen (anhand eines Tumor Nekrose Faktor neutralisierenden Nanobodies)

Plagmann, Ingo

Single-domain Antikörper oder Nanobodies besitzen aufgrund ihrer geringen Größe eine Reihe herausragender Eigenschaften, die sie in die Lage versetzen, Limitationen (z.B. Kosten, Stabilität, versteckte Epitope, Gewebegängigkeit) klassischer IgG-Antikörpertherapien zu überwinden. Zur Erweiterung ihrer Einsatzmöglichkeiten werden Antikörper häufig modifiziert und z.B. an Radionuklide oder Polyethylenglykol gekoppelt. Als neuartiger Ansatz zur gezielten Modifizierung von Nanobodies haben wir die Mikrobielle Transglutaminase (MTG) untersucht. Als Modellsystem der Modifizierung wurde die Dimerisierung mittels Ribonuklease A S-tag gewählt und am Beispiel eines Nanobodies gegen humanen Tumor Nekrose Faktor (hTNF) eine Methode zur MTG-induzierten Dimerisierung etabliert. Die dimeren Nanobodies wiesen gegenüber den monomeren Nanobodies eine um den Faktor 5 gesteigerte Aktivität auf. Auf Pflanzen basierende Expressionssysteme besitzen gegenüber klassischen Verfahren zur Produktion rekombinanter Proteine Vorteile wie Kostenersparnis, Erweiterbarkeit der Anbaufläche und etablierte Anbau- und Ernteverfahren. Die zentralen Einschränkungen wie geringe Proteinakkumulation und ineffiziente Aufreinigungsverfahren können durch Anfügen eines Elastin-ähnlichen Polypepitds (elastin-like polypeptide, ELP) überwunden werden. Die Anreicherung der rekombinanten Proteine in Pflanzen wird deutlich gesteigert und gleichzeitig ermöglicht der ELP-Anhang eine simple und effiziente Reinigungsmethode – das inverse transition cycling (ITC). Sie beruht auf reversibler Aggregation in Abhängigkeit von Temperatur und Salzkonzentration. Hier zeigen wir, dass das Anfügen eines ELP-Anhangs an den verwendeten Nanobody zu einer deutlichen Steigerung der Akkumulation auf über 2% des gesamten löslichen Proteins führt. Aktivitätstests des anhand ITC gereinigten anti-hTNFNanobody- ELP Fusionsproteins wiesen eine dem aus E. coli stammenden Nanobody vergleichbare Aktivität auf. In auf dieser Dissertation aufbauenden Experimenten verhinderten die anti-hTNF-Nanobody-ELP Fusionsproteine die Sterblichkeit im LPS/D-Gal Sepsis-modell der Maus komplett. Zudem war die Halbwertszeit des anti-hTNF-Nanobody- ELP Fusionsproteins gegenüber dem ursprünglichen Nanobody um den Faktor 20 verlängert. Die Modifizierung / Dimerisierung von Nanobodies mittels Mikrobieller Transglutaminase sowie die Expression und Aufreinigung von Nanobody-ELP Fusionsproteinen aus Pflanzen stellen interessante Weiterentwicklungen in der Nanobody-Technologie dar.

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Plagmann, Ingo: Entwicklung von Strategien zur Dimerisierung von Single-Domain Antikörpern (Nanobodies) sowie zu ihrer Produktion in transgenen Pflanzen (anhand eines Tumor Nekrose Faktor neutralisierenden Nanobodies). 2013.

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