Zuckerstoffwechsel in dem halophilen Archaeon Haloferax volcanii:Identifizierung und Charakterisierung von Enzymen des Fructose-und Glucosestoffwechsels und des Pentosephosphatwegs

Pickl, Andreas

Bisherige Untersuchungen zum Zuckerstoffwechsel in Archaea deuten darauf hin, dass in halophilen Archaea Fructose über einen modifizierten Embden-Meyerhof- (EM) Weg und Glucose über einen semiphosphorylierten Entner-Doudoroff- (ED) Weg abgebaut wird. Die Enzyme und die codierenden Gene für den Transport und den Abbau von Fructose wurden jedoch bisher nicht identifiziert und charakterisiert. Auch das Schlüsselenzym des ED-Wegs, die 2 Keto-3-desoxygluconat (KDG) Kinase, wurde bisher nicht identifiziert. Weiterhin lagen keine Daten zu den Enzymen vor, die in halophilen Archaea an der Bildung von Pentosephosphaten aus Hexosen beteiligt sind. In der vorliegenden Arbeit wurden Enzyme des Fructoseabbaus aus dem halophilen Modellorganismus Haloferax volcanii sowie der funktionell an der Fructoseaufnahme beteiligte Transporter identifiziert. Weiterhin wurde die funktionell am Glucoseabbau beteiligte KDG Kinase (KDGK) aus H. volcanii identifiziert und Enzyme des oxidativen Teils des Pentosephosphatwegs charakterisiert. Transport und Abbau von Fructose in H. volcanii Im Genom von H. volcanii wurde ein Cluster identifiziert, der für alle fünf Komponenten eines fructosespezifischen Phosphotransferase Systems (PTS) codiert. In Nachbarschaft dieses Bereichs wurden zwei Gene annotiert, die für die putativen Enzyme 1 Phosphofructokinase (1 PFK) und Fructose-1,6-bisphosphat (FBP) Aldolase (FBA) codieren (pfkB bzw. fba). Die Beteiligung der PTS Komponenten und der beiden Enzyme am Fructosestoffwechsel wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht. Northern-Blot Experimente ergaben, dass alle PTS Komponenten als Cotranskript bei Wachstum auf Fructose transkribiert wurden. Eine Deletionsmutante, bei der die PTS Transmembrankomponente EIIC (codiert von ptfC, wobei ptf für Phosphotransferase System für Fructose steht) chromosomal deletiert war, wurde generiert. Diese wuchs nicht mehr auf Fructose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle, aber unverändert auf Glucose, was für die funktionelle Beteiligung des PTS im Fructosestoffwechsel von H. volcanii spricht. Das PTS in H. volcanii ist der erste Nachweis eines funktionellen PTS in der Domäne der Archaea. Auf Grund von Sequenzhomologien und dem Vergleich der Genomorganisation zeigten die halophilen PTS Komponenten die größte Ähnlichkeit zu bakteriellen Homologen aus grampositiven Bakterien. Dies spricht für eine Aufnahme des PTS über einen lateralen Gentransfer von grampositiven Bakterien. Neben den PTS Komponenten war auch die Transkription von pfkB und fba bei Wachstum auf Fructose stark induziert. Mutanten, bei denen pfkB bzw. fba deletiert waren, konnten nicht mehr auf Fructose, jedoch auf Glucose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen, was für eine funktionelle Beteiligung der Enzyme am Abbau von Fructose spricht. 1-PFK und FBA wurden homolog in H. volcanii exprimiert und die gereinigten, rekombinanten Enzyme wurden charakterisiert. 1-PFK katalysierte die ATP abhängige Phosphorylierung von Fructose-1-phosphat (F1P) und Fructose-6-phosphat (F6P) zu Fructose-1,6-bisphosphat (FBP). Die katalytische Effizienz für die Umsetzung von F1P war etwa 36 fach höher als für F6P, was zeigt, dass F1P das physiologische Substrat der 1 PFK darstellt. Die rekombinante FBA wurde als eine metallabhängige Class II Aldolase beschrieben, die sowohl die Spaltung von FBP zu Glycerinaldehyd-3-phosphat (GAP) und Dihydroxyacetonphosphat (DHAP), als auch die umgekehrte Reaktion, das heißt die Aldolkondensation, katalysierte. Weiterführende Experimente mit der fba Deletionsmutante zeigten, dass fba in H. volcanii auch essentiell an der Gluconeogenese beteiligt ist. Phylogenetische Analysen ergaben, dass die FBA mit anderen putativen halophilen FBAs einen Cluster bildet, der separat von den bisher charakterisierten Class II Aldolasen liegt. KDG Kinasen aus H. volcanii Das Schlüsselenzym des semiphosphorylierten ED-Wegs des Glucoseabbaus, die KDG Kinase, wurde identifiziert und charakterisiert. Das Genom von H. volcanii enthält mit kdgK1 und kdgK2 zwei homologe Gene, die für die putativen KDG Kinasen KDGK-1 und KDGK-2 codieren. kdgK2 liegt in genomischer Nähe zu putativen galactosespezifischen Genen, was auf eine mögliche Funktion von KDGK-2 als 2-Keto-3-desoxygalactonat (KDGal) Kinase hinweisen könnte. Um zu prüfen, welche der beiden möglichen KDG Kinasen funktionell am Glucoseabbau beteiligt ist, wurde die Transkription beider Enzyme untersucht, die rekombinanten Enzyme exprimiert, gereinigt und charakterisiert, sowie das Wachstum von kdgK Deletionsmutanten auf Glucose und Galactose analysiert. Die Expression von kdgK1 auf Glucose und Galactose war konstitutiv. KDGK-1 katalysierte die ATP-abhängige Phosphorylierung von KDG mit einer etwa dreifach höheren katalytischen Effizienz als die Umsetzung von KDGal. Die kdgK1 Deletionsmutante wuchs nicht mehr in Medium mit Glucose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle, wogegen das Wachstum auf Galactose unverändert war. Dies spricht dafür, dass kdgK1 für die funktionelle KDG Kinase beim Abbau von Glucose im semiphosphorylierten ED-Weg von H. volcanii codiert. Die Expression von kdgK2 auf Galactose war stark induziert und die rekombinante KDGK-2 katalysierte die Phosphorylierung von KDGal mit einer 50 fach höheren katalytischen Effizienz als die Umsetzung von KDG. Die hohe Expression von kdgK2 auf Galactose sowie die hohe Spezifität für KDGal deuten darauf hin, dass es sich bei der KDGK-2 in vivo um eine funktionelle KDGal Kinase handelt. Oxidativer Teil des Pentosephosphatwegs in H. volcanii Die Enzyme des oxidativen Teils des Pentosephosphatwegs, die in H. volcanii die Umwandlung von Glucose zu Ribulose-5-phosphat katalysieren, wurden analysiert. In H. volcanii wurden Gene für eine putative ROK Kinase (ROK steht für Repressoren, ORFs unbekannter Funktion und Kinasen) und eine putative 6-Phosphogluconat Dehydrogenase annotiert. Ein Gen für eine bekannte Glucose-6-phosphat (G6P) Dehydrogenase war nicht annotiert. In der vorliegenden Arbeit wurden die ROK Kinase und die 6-Phosphogluconat Dehydrogenase als rekombinante Proteine nach homologer Expression gereinigt und charakterisiert, sowie eine G6P Dehydrogenaseaktivität aus H. volcanii Zellextrakt gereinigt und identifiziert. Die ROK Kinase katalysierte die ATP-abhängige Phosphorylierung von Glucose zu G6P mit apparenten Km- und Vmax-Werten von 0,16 mM und 182 U/mg. Andere Zucker wurden nicht oder nur mit geringer katalytischer Effizienz umgesetzt. Zum Vergleich mit anderen archaeellen Enzymen wurde eine zweite ROK Kinase aus dem Crenarchaeon Desulfurococcus kamchatkensis charakterisiert. Im Gegensatz zur halophilen ROK Kinase aus H. volcanii katalysierte diese nicht nur die Phosphorylierung von Glucose, sondern auch die Umsetzung von Fructose und Mannose mit vergleichbaren katalytischen Effizienzen. In Übereinstimmung mit der unterschiedlichen Substratspezifität konnten die beiden charakterisierten Kinasen auch verschiedenen phylogenetischen Clustern zugeordnet werden. Aus Zellextrakten von H. volcanii wurde eine G6P Dehydrogenase bis zur apparenten Homogenität gereinigt und mittels MALDI-TOF Massenspektroskopie das codierende Gen identifiziert. Das Enzym katalysierte die NAD+ abhängige Oxidation von G6P mit einer Rate von 39 U/mg und apparenten Km-Werten von 5,4 mM und 0,18 mM für G6P und NAD+. NADP+ wurde nicht als Elektronenakzeptor verwendet. Phylogenetische Untersuchungen ergaben, dass die G6P Dehydrogenase aus Haloferax eine neuartige G6P Dehydrogenase ist, die der extended short-chain dehydrogenase/reductase (SDRe) Familie zugeordnet werden kann. Dies ist die erste Beschreibung einer Glucose-6-phosphat Dehydrogenase in der Domäne der Archaea. Die rekombinante 6-Phosphogluconat Dehydrogenase katalysierte die NAD+ abhängige Oxidation von 6-Phosphogluconat mit apparenten Km- und Vmax-Werten von 0,021 mM und 10,6 U/mg. NADP+ diente nicht als physiologischer Elektronenakzeptor. Die Ergebnisse zeigen, dass H. volcanii Enzyme enthält, die Glucose über G6P zu Ribulose-5-phosphat umsetzen.

Comparative analyses on sugar catabolism revealed that degradation of fructose in halophilic archaea is carried out by a modified Embden-Meyerhof (EM) pathway whereas glucose is degraded via a semiphosphorylative Entner-Doudoroff (ED) pathway. However, enzymes and coding genes for the transport and degradation of fructose have not been identified and characterized yet. Furthermore, 2-keto-3-deoxygluconate (KDG) Kinase, the key enzyme of the semiphosphorylative ED pathway, has not been identified. Moreover, no enzymes for the generation of pentose phosphates from hexoses have been described in halophilic archaea. In this study, enzymes of the fructose catabolism from the halophilic model organism H. volcanii have been identified and characterized. Furthermore, the functionally involved fructose transport system was identified. Also the KDG Kinase (KDGK), which is functionally involved in glucose catabolism in H. volcanii, has been identified, and enzymes of the oxidative pentose phosphate pathway have been characterized. Transport and Degradation of Fructose in H. volcanii Analyses of the H. volcanii genome indicate the presence of a cluster, encoding homologs of all five bacterial phosphotransferase system (PTS) components. Directly upstream and downstream of this cluster, respectively, genes coding for putative fructose-1phosphate kinase (1-PFK) and fructose-1,6-bisphosphate aldolase (FBA) were annotated (pfkB respectively fba). In this study, the functional involvement of the PTS components and the two enzymes 1-PFK and FBA in fructose catabolism has been investigated. Northern blot analysis revealed that all PTS components were expressed as a cotranscript that was specifically upregulated by fructose. A mutant with chromosomally deleted PTS transmembrane component EIIC (encoded by ptfC, ptf stands for phosphotransferase system for fructose) was generated. The ptfC mutant did not grow on fructose as sole carbon and energy source, whereas growth on glucose was unaffected. These results indicate that ptfC and the entire PTS operon in H. volcanii is functionally involved in fructose uptake as a part of fructose catabolism. This is the first report of the functional involvement of a bacterial PTS in the domain of the archaea. Based on comparisons of sequences and genome organizations from the halophilic PTS to bacterial counterparts, a high degree of similarity to gram positive bacteria could be detected, indicating that the halophilic PTS might have been acquired via horizontal gene transfer from the domain of the bacteria. In analogy to the PTS components, fructose specific induction of pfkB and fba could be detected by Northern blot analyses. Mutants with chromosomally deleted pfkB or fba did not grow on fructose as sole carbon and energy source, but growth on glucose was not affected. These data indicate that pfkB and fba are essential for growth on fructose. 1-PFK and FBA were homologously expressed, purified and characterized. 1-PFK catalyzed the ATP dependent phosphorylation of fructose-1-phosphate (F1P) and fructose-6-phosphate (F6P) to fructose-1,6-bisphosphate (FBP). The catalytic efficiency (kcat/Km) of the enzyme for F1P was about 36 fold higher than for F6P, indicating that F1P is the physiological substrate defining the enzyme as F1P-specific kinase (1-PFK). FBA was described as metal dependent Class II aldolase, catalyzing the cleavage of FBP to glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) and dihydroxyacetone phosphate (DHAP). Moreover, it was shown that the enzyme catalyzed the reverse reaction. Further experiments with the fba deletion mutant showed that fba is essentially involved in gluconeogenesis of H. volcanii. Phylogenetic analyses revealed that halophilic FBAs formed a distinct cluster apart from other characterized aldolases, suggesting that haloarchaeal class II FBAs form a separate class II FBA subfamily. KDG Kinases of H. volcanii In this thesis, the key enzyme of the semiphosphorylative ED pathway, the KDG kinase, has been identified and characterized. H. volcanii codes for two putative KDG kinases with high sequence similarity (KDGK-1 and KDGK-2, encoded by kdgK1 and kdgK2). In close vicinity to kdgK2, putative galactose specific genes are annotated, indicating a possible role of KDGK-2 as 2-keto-3-deoxygalactonate (KDGal) Kinase. To check, which one of the kinases is functionally involved in glucose catabolism, transcription analyses were performed. Furthermore, the recombinant enzymes were expressed, purified and characterized and the growth of kdgK deletion mutants was analyzed. The expression of kdgK1 on glucose and galactose as sole carbon and energy source was constitutive. KDGK-1 catalyzed the ATP dependent phosphorylation of KDG and KDGal with an approximately threefold higher catalytic efficiency for KDG. The kdgK1 deletion mutant did not grow on glucose as sole carbon and energy source, whereas growth on galactose was not affected. These data indicate that kdgK1 is the functional KDG Kinase for the degradation of glucose via the semiphosphorylative ED pathway in H. volcanii. The expression of kdgK2 on galactose was highly induced and the recombinant KDGK-2 catalyzed the phosphorylation of KDGal with a 50 fold higher catalytic efficiency than the phosphorylation of KDG. The high expression of kdgK2 on galactose and the specificity of KDGK-2 for KDGal indicates that KDGK-2 is the functional KDGal Kinase in vivo. Oxidative Pentosephosphate Pathway in H. volcanii The enzymes of the oxidative pentosephosphate pathway that catalyze the transformation of glucose to ribulose-5-phosphate in H. volcanii have been analyzed. Genes encoding for the putative enzymes ROK kinase (ROK stands for repressors, open reading frames of unknown function and kinases) and 6-phosphogluconate dehydrogenase were found to be annotated in H. volcanii. However, the gene for a classical glucose-6-phosphate (G6P) dehydrogenase was not annotated. In this work, ROK kinase and 6-phosphogluconate dehydrogenase were homologously expressed, and the recombinant enzymes were purified and characterized. Furthermore, a novel G6P dehydrogenase from cell extract was purified and identified. The ROK kinase catalyzed the phosphorylation of glucose to G6P with apparent Km- and Vmax- values of 0.16 mM and 182 U/mg. Other sugars than glucose were not phosphorylated with high catalytic efficiency. For comparison to other archaeal enzymes, a second ROK kinase from the crenarchaeon Desulfurococcus kamchatkensis was characterized. Unlike the halophilic enzyme from H. volcanii, this kinase not only phosphorylated glucose but also other sugars like fructose or mannose with comparable catalytic efficiencies. In accordance to the difference in substrate specificity, the kinases formed distinct clusters in the phylogenetic tree. G6P dehydrogenase from H. volcanii cell extract was purified to homogeneity and the encoding gene was identified by MALDI-TOF mass spectrometry. The enzyme catalyzed the NAD+ dependent oxidation of G6P with a specific activity of 39 U/mg and apparent Km-values of 5.4 mM and 0.18 mM for G6P and NAD+, respectively. NADP+ was not used as electron acceptor. Phylogenetic analyses revealed that G6P dehydrogenase from Haloferax constitutes a novel G6P dehydrogenase that belongs to the extended short-chain dehydrogenase/reductase (SDRe) family. This is the first report of an archaeal G6P dehydrogenase. The recombinant 6-phosphogluconate Dehydrogenase catalyzed the NAD+ dependent oxidation of 6-phosphogluconate with apparent Km- and Vmax- values of 0.021 mM and 10.6 U/mg. The enzyme could not use NADP+ as physiological electron acceptor. The results show that H. volcanii codes for all genes that catalyze the conversion of glucose to ribulose-5-phosphate via glucose-6-phosphate.

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Pickl, Andreas: Zuckerstoffwechsel in dem halophilen Archaeon Haloferax volcanii:Identifizierung und Charakterisierung von Enzymen des Fructose-und Glucosestoffwechsels und des Pentosephosphatwegs. 2013.

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