Umfassende Inhaltsstoffprofilierung von Actaea Drogen/Zubereitungen,präparative Herstellung von Fraktionen sowie Isolierung, Nachweis und Bioverfügbarkeit von lead substances in Zusammenhang mit in vivo und in vitro Studien mittels hoch auflösender state-of-the-art Methoden

Schuh, Markus

Eine Trockenextrakt-Zubereitung aus dem Wurzelstock der Traubensilberkerze (Actaea racemosa L., syn. Cimicifuga racemosa (L.) Nutt.) wird in Fertigarzneimitteln seit Jahrzehnten erfolgreich und wissenschaftlich belegt zur Linderung von Wechseljahresbeschwerden eingesetzt. Die Anwendungsgebiete umfassen Hitzewallungen und Schweißausbrüche, psychische Beschwerden, Schlafstörungen, Störungen der Blase und Harnwege sowie die Prophylaxe bei der Entwicklung einer menopausalen Osteoporose. Pflanzliche Fertigarzneimittel, die A. racemosa Zubereitungen enthalten, zeigen sehr gute evidenzbasierte Wirksamkeit bei hoher Arzneimittelsicherheit und geringem Nebenwirkungsrisiko. Dadurch bestätigt sich der Einsatz als Alternative zu einer Hormonersatztherapie, welche mit höherem Nebenwirkungsrisiko behaftet ist, sowie mit dem Risiko der Entwicklung eines Mammakarzinoms. Der Aufklärung der Wirkungsweise sowie dem Erforschen der aktiven Wirkstoffe aus dem BNO 1055 Trockenextrakt aus A. racemosa wurde das Hauptaugenmerk in der Arbeit gewidmet. Durch die Entwicklung eines Fraktionierungsprozess konnte der Trockenextrakt in eine lipophile und eine hydrophile Fraktion getrennt werden. Anschließend wurden mittels präparativer Chromatographie beide Fraktionen in 6 Unterfraktionen geteilt. Mit hochsensitiver Massenspektrometrie (triple ToF/MS) konnte eine umfassende Charakterisierung der Fraktionen bzw. des Gesamtextraktes durchgeführt werden. Actein und 27-Deoxyactein konnten als Hauptinhaltsstoffe in der Subfraktion L 2 identifiziert werden, während die lipophileren Saponine wie Cimiracemosid C, Cimigenolxylopyranosid und Acetylcimigenolxylopyranosid in der Fraktion L 3 vorhanden waren. Die hydrophilen Unterfraktionen sind charakterisiert durch den hohen Anteil an Zuckern (H 1) und die bekannten Phenylpropanoide (H 2). In der Unterfraktion H 3 konnten die N-haltigen Verbindungen Cimipronidin und Cyclocimipronidin, sowie das Serotonin-Analogon Nω Methylserotonin nachgewiesen werden. Alle Unterfraktionen, der Gesamtextrakt sowie die lipophile und hydrophile Fraktion wurden in Zusammenarbeit mit der Medizinischen Fakultät der Georg-August-Universität Göttingen auf pharmakologische Wirkung untersucht. Der Gesamtextrakt, die LF und die L 2 Fraktion konnten signifikant die Entwicklung einer Osteoporose von ovariektomierten Ratten verhindern. Aufgrund der Wirksamkeit der L 2-Fraktion und deren Hauptinhaltsstoff 27-Deoxyactein wurde diese Verbindung mit Hilfe eines Caco 2 Permeabilitätsassay auf ihre Bioverfügbarkeit untersucht. Zu diesem Zweck konnte eine LC-MS Methode (HPLC-Methode 06) zur Quantifizierung von 27 Deoxyactein erfolgreich validiert werden. Vorab durchgeführte Toxizitätsversuche zeigten, dass der Gesamtextrakt in keiner Weise toxisch auf die Caco Zellen wirkte. Anhand des Permeabilitätsassay konnte für 27-Deoxyactein ein Papp-Wert von A → B von 10,6 x e-6 bzw. 9,2 x e-6 in den Extrakten C001 und C005 ermittelt werden. Die Transporte wurden ebenso in umgekehrter Richtung durchgeführt, dabei wurde bei C001 ein Papp-Wert von 17,4 x e-6 und bei C005 von 21,3 x e-6 für 27-Deoxyactein berechnet. Die errechnete Efflux-Ratio, die einen Aufschluss auf den Transportmechanismus zulässt, ergab im Mittel einen Wert von 2, woraus man auf die aktive Sekretion der Substanz schließen kann. Nach der Identifizierung von Nω-Methylserotonin in A. racemosa wurde im dritten pharmakologischen Teil der Arbeit in einem zellbasierten funktionellen Bindungsassay untersucht, inwiefern der Gehalt von Nω-Methylserotonin in unterschiedlichen Drogenchargen mit der Bindungsaffinität an den Serotoninrezeptor 5-HT 7 und damit der Wirksamkeit der Drogenchargen korreliert. Ein eindeutiger Zusammenhang zwischen dem ermittelten Gehalt von Nω-Methylserotonin und der EC 50 aus dem Bindungsassay konnte nicht nachgewiesen werden. Vielmehr scheint das Zusammenspiel unterschiedlicher Substanzen in der Pflanze für die Wirkung verantwortlich zu sein. Der 5-HT 7 Rezeptor konnte durch diese Arbeit aber als ein Target von Actaea racemosa Zubereitungen identifiziert werden. Die Traubensilberkerze gilt als eine hochpotente Arzneipflanze, deren detaillierte Erforschung noch weitere Jahre andauern wird. Durch diese Arbeit konnte eine umfassende Inhaltsstoffprofilierung sowie ein reproduzierbarer Fraktionierungsprozess erstellt werden. Es konnte gezeigt werden, dass Saponine aus der lipophilen Fraktion L 2 protektiv gegen Osteoporose in der Menopause wirken, während die Bestandteile der hydrophilen Fraktion H 3 spezifisch serotonerge und dopaminerge Wirkungen aufweisen und damit die zentralnervösen klimakterischen Beschwerden positiv beeinflussen. Diese Daten sowie der durchgeführte Fraktionierungsprozess könnten zukünftig dazu beitragen, hochspezifische Trockenextrakte zur Behandlung von Erkrankungen in der Menopause herzustellen.

Herbal medicinal products with specific extracts from rhizome and root material of black cohosh [Actaea racemosa L., syn.: Cimicifuga racemosa (L.) Nutt.] are widely accepted to relieve climacteric symptoms in postmenopausal women. The indication encompasses hot flushes, mental and sleep disorders, bladder diseases and prophylaxis of menopausal osteoporosis. Phytotherapeutics containing black cohosh show high evidence based efficacy with a good safety profile. This justifies black cohosh to be a promising phytotherapeutic alternative to hormone replacement therapy which is usually associated with a high risk of adverse events as well as the risk of development breast cancer. The aim of the thesis was to explore active components and their mode of action of BNO 1055 dry extract. In the first part the special extract BNO 1055 from black cohosh was fractionated by preparative chromatograhy into six subfractions which were subsequently characterised by high resolution mass spectrometry (LC/ToF-MS). Analytical data clearly prove the presence of the main triterpene glycosides acteine and 27 deoxyacteine in the lipophilic subfractions L 2 whereas cimiracemoside C, cimigenolxylopyranoside and acetylcimigenolpyranoside were present in L 3. High amounts of carbohydrates characterised H 1. The hydrophilic subfraction H 2 contained phenylpropanic acid derivatives. Nω-methylserotonin as well as the alkaloids cimipronidine and cyclocimipronidine were identified in H 3. Additionally in cooperation with the medical department of the Georg-August-Universität Göttingen the development of osteoporosis in ovariectomised rats was shown to be inhibited significantly by the whole extract, LF and L 2 fraction. Further bioavailability of 27-deoxyactein was determined by using a caco-2 permeability assay. For this purpose a LC-MS quantification method was successfully validated. Preliminary toxicity test results showed no cytotoxic activity of the whole extract against caco-cells. The permeability assay determined Papp-values of 10.6 x e-6 and 9.20 x e-6 respectively for 27-deoxyacteine in the extracts C001 and C005 for efflux from A to B. Papp-values of 17.4 x e-6 and 21.3 x e-6 respectively for 27-deoxyacteine in C001 and C005 were computed for reverse direction. The calculated efflux ratio, which suggest the preferred mechanism of transport, was 2 indicating an active secretion of 27-deoxyacteine. In addition using a cell-based functional binding assay a distinct correlation between the content of Nω methylserotonin and the binding affinity to the serotonin receptor 5-HT 7 in different drug batches could not be shown. This indicates that the content of Nω methylserotonin is not solely responsible for the efficacy of black cohosh; this is rather accounted to an interaction of various components of the plant. Confirmation of the 5-HT 7 receptor as a target of black cohosh could be demonstrated in this study. Black cohosh is considered to be a highly potent medicinal plant and years of further research will be needed to fully explore its broad range of efficacy in climacteric disorders. Within this thesis a complete ingredient screening and fractionation process was performed. The data showed that saponines from the lipophilic fraction L 2 are protective against osteoporosis, whereas the constituents of the hydrophilic fraction exhibit specifically serotonergic and dopaminergic actions and could therefore positively influence central nervous climacteric symptoms. These data and the fractionation process used may contribute to establish high specific and targeted dry extracts in the future.

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Schuh, Markus: Umfassende Inhaltsstoffprofilierung von Actaea Drogen/Zubereitungen,präparative Herstellung von Fraktionen sowie Isolierung, Nachweis und Bioverfügbarkeit von lead substances in Zusammenhang mit in vivo und in vitro Studien mittels hoch auflösender state-of-the-art Methoden. 2014.

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