Hypoxia tolerance of jumbo squids (Dosidicus gigas) in theEastern Pacific oxygen minimum zones : physiological andbiochemical mechanisms

Marine hypoxia has become one of the major concerns of the world, as oceanic dead zones continue expanding horizontally and vertically, a phenomenon primarily caused by global warming and anthropogenic eutrophication. As consequence, drastic changes in community structures, predator-prey relationships (i.e. uncoupling) and/or habitat compression are expected followed by severe impacts on food-webs, ecosystems and fisheries. Moreover, habitat compression is aggravated by the synergistic effects of climate change, as elevated temperature and PCO2 will narrow the habitat from above. The jumbo squid, Dosidicus gigas, undergoes diel vertical migrations into oxygen minimum zones (OMZs) off the Eastern Tropical Pacific, where he plays an important ecological role both as predator and prey. In fact, this species can easily remove more than 4 million tons of food per year from the pelagic food web and is an important component in the diets of birds, fishes, and mammals. Besides its ecological role, the jumbo squid also plays an important economically role being target of the world’s largest cephalopod fishing industry with around 14% of world’s total squid catch and landings estimated at 818,000 tons in 2006. However, the main problem that arises with hypoxia is a reduced gradient that drives O2 uptake via diffusion pathways. At some point, the critical O2 partial pressure (Pcrit), the reduced diffusion gradient cannot support the metabolic demand fully aerobically, and has to be supplemented by anaerobic pathways and/or compensated by a reduction in metabolic rate. Commonly, aquatic animals respond to hypoxia by first attempting to maintain O2 delivery, as aerobic metabolism is much more efficient, followed by conserving energy expenditure and reducing energy turn over and finally by enhancing energetic efficiency of those metabolic processes that remain and derive energy from anaerobic sources. A further problem that vertical migrators of OMZs have to face is the elevated production of radical oxygen species (ROS) during the reoxygenation phase while ascending, as non-neutralized ROS formation can damage biological macromolecules (i.e. lipids, proteins and DNA) resulting in severe functional alterations in cells and tissues. To determine the cost and benefits of such diel vertical migrations, I investigated biochemical and physiological mechanisms in juvenile D. gigas off the Gulf of California with a focus on ventilation, locomotion, metabolism and antioxidant defense. The respiratory regulation in D. gigas was unpredictably high and is mirrored in maximized oxygen extraction efficiencies (EO2) at early (EH, < 160 min, 1 kPa O2) and late hypoxia (LH, > 180 min, 1 kPa O2). EO2 at EH was maximum 82% and achieved via (1) deep-breathing mechanism with more powerful contractions and an enlarged inflation period, and (2) reduction in the relaxed mantle diameter to favor diffusion. At LH, EO2 was still 40%, despite all other ventilatory mechanisms were drastically reduced, probably by using the collar-flap system (uncoupling of locomotory and ventilatory mechanisms) and a further reduction in the relaxed mantle diameter. Moreover, the drastic change in locomotion between EH and LH (onset of lethargy) was accompanied by a switch in the energy source of anaerobic pathways. At EH, anaerobic energy equivalents (AEE) primarily arrived via rapid energy reserve depletion (ATP, phospho-L-arginine), and, under LH, was mainly obtained via fermentative pathways (mainly octopine). As octopine formation simultaneously creates protons, intracellular acidosis and acid-base disturbances under progressing hypoxia are expected, which might negatively impact squid’s energy household and expenditures from locomotion towards more important cellular processes (i.e. ion regulation). Energy reserve depletion might even trigger lethargic behavior to conserve energy and extend hypoxia residence time. At EH, in contrast, deep-breathing behavior enabled D. gigas to pass the same amount of water through the mantle cavity per period of time and thereby could maintain a stable ventilatory volume per min, which explains its high level of activity observed under such extreme conditions. Moreover, D. gigas suppressed its metabolism (45-60%) at severe hypoxia (below Pcrit), as the reduction in O2 consumption rate (70-80%) could not be compensated by an upregulation in anaerobic energy production (70%). Cephalopods primarily feed on proteins and their glycogen storage potential is low (< 0.4% of body weight). Therefore anaerobic protein degradation came into focus as strategy in hypoxia tolerant species. Yet, total protein concentration in muscle tissue of D. gigas did not vary significantly under severe hypoxia, but the reduced protein expression of heat shock protein 90 (Hsp90) and α- actinin indicates that, at least under progressing hypoxia, jumbo squids might degrade specific muscle proteins anaerobically. Moreover, the lower α-actinin expression at LH might be related to a decreased protection via the Hsp90 chaperon machinery resulting in increased ubiquitination and subsequent degradation. Therefore, the ubiquitin-proteasome system seems to play an important role in hypoxia tolerance, but further investigations are necessary to discover its full potential and pathways. Antioxidant enzyme activities in D. gigas were generally low and in the range of other squid species, but malondialdehyde concentrations (indicative of cellular damage) did not significantly change between normoxic and hypoxic conditions, demonstrating an efficient antioxidant defense system. Moreover, superoxide dismutase and catalase activities were enhanced under normoxia that seem to constitute an integrated stress response at shallower depths by buffering increased ROS formation, and, in addition, might even be a strategy to cope with the reoxygenation/recovery process. Moreover, heat shock protein 70 concentration was significantly increased under severe hypoxia (1 kPa O2), which may constitute a preparation for the reoxygenation phase during squid’s upward migration. Accordingly, the present thesis demonstrates that D. gigas evolved a variety of adaptive mechanisms and strategies to cope with hypoxia and the imposed challenges of diel vertical migrations. D. gigas might even actively descent into OMZs to suppress metabolism and escape from high metabolic demands at surface waters. Especially the high O2 uptake capacity and respiratory regulation were surprising taking into account cephalopods physiological and anatomical restraints. Therefore, D. gigas seems well-adapted to hypoxic conditions and might even out-compete less hypoxia tolerant species under hypoxia expansion, but the synergistic impacts of climate change, in turn, might endanger its survival.

Die vertikale und horizontale Ausbreitung mariner Hypoxie hat sich zu einem der grössten Umweltprobleme der Welt entwickelt, ein Phänomen, dass hauptsächlich durch die globale Erwärmung und anthropogene Eutrophierung verursacht wird. Als Konsequenz sind drastische Veränderungen in der Zusammensetzung und dem Aufbau mariner Tier- und Pflanzengemeinschaften, sowie Änderungen in Räuber-Beute Beziehungenen (z.B. durch Entkopplung) und/oder eine Komprimierung der Lebensräume zu erwarten, was erhebliche Einflüsse auf die Nahrungsnetze, Ökosysteme und Fischerei zur Folge haben wird. Zudem wird die Komprimierung der Habitate durch die synergistischen Effekte der Klimaveränderung verschärft, da erhöhte Temperaturen und PCO2-Werte die Lebensräume zusätzlich von oben her einengen. Der Riesen-Flugkalmar, Dosidicus gigas, unternimmt tägliche Vertikalwanderungen in die Sauerstoffminimumzonen (OMZs) des östlichen tropischen Pazifiks, wo er eine wichtige ökologische Rolle als Räuber und Beute spielt. Tatsächlich kann diese Art mit Leichtigkeit mehr als 4 Millionen Tonnen Nahrung pro Jahr aus dem pelagischen Nahrungsnetz entfernen und ist ein wichtiger Bestandteil auf dem Speiseplan von Vögeln, Fischen und Säugetieren. Neben seiner ökologischen Stellung nimmt der Riesen-Flugkalmar auch eine bedeutende wirtschaftliche Rolle ein, da er eine der begehrtesten Zielscheiben der Fischereiindustrie für Kopffüssler ist und dabei alleine 14% des gesamten weltweiten Tintenfischfangs abdeckt mit geschätzten Anlandungen von 818,000 Tonnen im Jahr 2006. Das Hauptproblem der Hypoxie ist ein verringerter Gradient, der die Sauerstoffaufnahme über Diffusionswege steuert. Erreicht dieser Gradient den kritischen Sauerstoffpartialdruck (Pcrit) können die Anforderungen des Stoffwechsels nicht mehr alleine durch Atmungsprozesse abgedeckt werden, und muss daher mit Hilfe anaerober Stoffwechselwege ergänzt und/oder mit einer Reduktion des Stoffwechsels kompensiert werden. Weil der aerobe Stoffwechsel viel energiereicher ist versuchen aquatische Organismen unter Hypoxie als erstes den Sauerstofftransport aufrecht zu erhalten, gefolgt von der Konservierung von Energieausgaben, einem verringertem Energieumsatz, und letztendlich durch die Erhöhung der Energieeffizienz von Stoffwechselprozessen, welche Energie aus anaeroben Quellen beziehen und aufrechterhalten. Ein weiteres Problem, das sich Vertikalwanderer in OMZs stellen müssen, ist die erhöhte Produktion von Sauerstoffradikalen (ROS) während der Reoxygenierungsphase beim Aufsteigen, da nicht neutralisierte ROS Formierungen biologische Makromoleküle (wie z.B. Lipide, Proteine und DNA) beschädigen können, was wiederum erhebliche funktionelle Veränderungen in Zellen und Geweben hervorrufen kann. Um die Kosten und Vorteile solcher Vertikalwanderungen bestimmen zu können, habe ich ihm Rahmen meiner Doktorarbeit die biochemischen und physiologischen Mechanismen juveniler Riesen-Flugkalmare aus dem Golf von Kalifornien untersucht, und mich dabei auf die Atmung, die Bewegung, den Stoffwechsel und die Antioxidansabwehr fokussiert. Die respiratorische Regulierung in D. gigas war wiedererwartend hoch und wiedergespiegelt in einer erhöhten Sauerstoffaufnahmeeffizienz (EO2) sowohl unter früher (EH, < 160 min, 1 kPa O2) als auch unter später Hypoxie (LH, > 180 min, 1 kPa O2). Die EO2 unter EH erreichte einen maximalen Wert von 82% und wurde erzielt durch (1) einen Tief- Atmungs-Mechanismus mit kraftvolleren Mantelkontraktionen und einer verlängerten Inflationsperiode, und (2) eine Verringerung des Manteldurchmessers (im Ruhezustand) um die Sauerstoffaufnahme über Diffusion zu steigern. Unter LH, EO2 betrug weiterhin 40%, obwohl alle anderen Atmungsmechanismen drastisch reduziert waren. Dies wurde vermutlich erzielt durch die Anwendung des sogenannten Mantelkragen-Klapp-Systems (durch Entkopplung der Ventilation von den Bewegungsabläufen) und einer weiteren Reduzierung des Manteldurchmessers (im Ruhezustsand). Desweiteren, war die drastische Änderung der Lokomotion/Atmung zwichen EH und LH (Startpunkt der Lethargie) begleitet von einer Umstellung in der Energieverstoffwechslung unter anaeroben Bedingungen. Während der Grossteil der anaeroben Energieequivalente (AEE) unter EH durch den schnellen Abbau von Energiereserven (ATP, Phospho-L-Arginin) gedeckt werden konnte, wurde unter LH der Hauptanteil über Fermentationswege (hauptsächlich Oktopin) gewonnen. Die Bildung des anaeroben Endproduktes Oktopin aber erzeugt gleichzeitig Protonen, und daher sind intrazelluläre Versauerung und Störungen des Säure-Base Gleichgewichtes zu erwarten. Daher sind Störungen/Änderungen im Energiehaushalt und seinen Ausgaben zu erwarten mit einem erhöhten Fokus auf wichtige zelluläre Prozesse (wie z.B. Ionenregulation) anstelle der Lokomotion. Zusätzlich ist es möglich, dass die Ausbeutung von Energiereserven selbst lethargisches Verhalten auslöst, um Energieausgaben zu konservieren und die Aufenthaltszeit unter hypoxischen Bedingungen zu verlängern. Im Gegensatz dazu, ermöglichte das Tief-Atmungs-Verhalten von D. gigas unter EH einen konstanten Wassertransport durch die Mantelhöhle pro Zeitintervall wie unter normoxischen Bedingungen, was den hohen Aktivitätsgrad unter solchen extremen Bedingungen erklären könnte. Zusätzlich zeigte D. gigas unter Hypoxie eine aktive Absenkung seines Stoffwechsels (45- 60%), da die verringerte Atmungsrate (70-80%) nicht durch die Aktivierung anaerober Stoffwechselwege kompensiert werden konnte (AEE 70% erhöht). Kopffüssler unter normoxischen Bedingungen beziehen ihre Energie weitgehend aus Proteinen und ihr Potential Glykogen zu speichern ist äusserst begrenzt (< 0.4% des Körpergewichts). Daher könnnte der anaerobe Abbau von Proteinen eine wichtige Rolle in der Hypoxietoleranz von Kopffüsslern spielen, als weitere Strategie, um die Aufenthaltszeit in OMZs zu verlängern. Die Proteinkonzentration im Muskelgewebe von D. gigas allerdings variierte nicht signifikant unter dem Einfluss von Hypoxie (1 kPa O2), trotzdem konnte eine reduzierte Proteinexpression des Hitzeschockproteins 90 (Hsp90) und α-actinin entdeckt werden, was zumindest unter fortschreitender Hypoxie darauf schliessen lässt, dass D. gigas spezifische Muskelproteine anaerobisch verstoffwechselt. Weiterhin scheint die verringerte Expression von α-actinin unter LH mit einem reduzieten Schutz der Hsp90 Chaperon-Maschinerie zusammenzuhängen, was wiederum eine erhöhte Ubiquitinierung mit anschliessender Degradierung zur Folge hat. Dies lässt darauf schliessen, dass das Ubiquitin-Proteasom- System eine entscheidende Rolle in der Hypoxietoleranz spielt, aber weitere Untersuchungen sind notwending um das gesamte Potential und seine Pfade erfassen zu können. Die antioxidantischen Enzymaktivitäten in D. gigas zeigten generell niedrige Werte im Bereich anderer Tintenfischarten, wobei die Malondialdehydkonzentrationen (Anzeiger für Zellschäden) keine signifikanten Veränderungen zwischen Normoxie und Hypoxie aufzeigte, was wiederum einen effizienten Antioxidansabwehrmechanismus aufzeigt. Zudem waren die Enzymaktivitäten von Superoxiddismutase und Katalase unter Normoxie gesteigert, was mit einer integrierten Stressantwort im Oberflächenwasser zusammenzuhängen scheint, und möglicherweise sogar selbst eine Strategie darstellt, um mit der Reoxygenierung/ Erholungsphase umzugehen, um die erhöhte ROS Produktion abzupuffern. Die signifikante Erhöhung der Hitzeschockprotein 70 Konzentration unter Hypoxie (1 kPa O2) scheint dabei eine zusätzliche Vorsorgemassnahme bezüglich der Reoxygenierungsphase in aufsteigenden Riesen-Flugkalmaren darzustellen. Die Ergebnisse meiner Doktorarbeit zeigen, dass D. gigas eine Vielzahl von adaptiven Mechansimen und Strategien entwickelt hat, welche ihm ermöglichen mit hypoxischen Bedingungen und den Herausforderungen der Vertikalwanderungen umzugehen. D. gigas sucht dabei möglicherweise absichtlich OMZs auf, um seinen hohen Energieverbrauch aktiv zu unterdrücken, um vor seinen hohen Stoffwechselanforderungen im Oberflächenwasser zu flüchten. Besonders die erhöhte Sauerstoffaufnahmeeffizienz und respiratorische Regulation waren überraschend, vor allem unter dem Aspekt der physiologischen und anatomischen Beinträchtigungen die Kopffüssler typischerweise charakterisieren. Daher scheint D. gigas sehr gut an hypoxische Bedingungen angepasst zu sein und kann vermutlich bei weiterer Hypoxieausbreitung weniger tolerante Arten verdrängen. Trotzalledem könnten die synergistischen Einflüsse des Klimawandels das Überleben von D. gigas drastisch beinträchtigen.


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