Die proteolytische Freisetzung des T Zell Immunglobulin- und Mucindomänen Proteins 2 (TIM-2) ist ADAM10-abhängig und wird durch Calmodulin beeinflusst

Dewitz, Christin

Die genomischen Regionen der TIM (T Zell Immunglobulin- und Mucindomänen) Proteine stehen in Verbindung mit zahlreichen Krankheiten, einschließlich allergischen Reaktionen, Transplantationstoleranz, Autoimmun-reaktionen und Krebs (Freeman et al., 2010). Es existieren acht murine TIM-Gene (mTIM-1 - mTIM-8), sowie drei humane (hTIM1, hTIM-3, hTIM-4). Das murine TIM-2 Protein hat kein Ortholog im Menschen, weist aber eine große Sequenzhomologie mit mTIM-1 auf, welches nach erfolgter Proteolyse auch als lösliche Variante beschrieben wurde. Zahlreiche Transmembranproteine werden von der Zelloberfläche durch Proteasen abgespalten, wodurch lösliche Ektodomänen entstehen, die es ermöglichen, immunologische Prozesse einzuleiten, die Stärke der Immunantwort zu regulieren und diese auch zu beenden. TIM-2 ist, wie alle TIM Rezeptoren, ein Typ I Transmembranprotein und wird hauptsächlich auf differenzierten Th (T-Helfer)2 Zellen sowie aktivierten B Zellen exprimiert. Der Aufbau der TIM Proteine ist ähnlich strukturiert wie der, des membranständigen CX3CL1 Chemokins (Fraktalkin), von dem bereits bekannt ist, dass es durch ADAM10 und ADAM17 prozessiert wird. Darauf aufbauend wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob das murine TIM-2 Protein ein Substrat von ADAM10 oder 17 ist. Für die Aktivierung von ADAM17 wurde der Phorbolester PMA (Phorbol-12-myristat-13-acetat) als Stimulus verwendet und zur ADAM10-Induktion das Ionophor Ionomycin sowie BzATP (2'(3')-O-(4-Benzoylbenzoyl)Adenosin-5'-Triphosphat). Mit Hilfe von spezifischen ADAM10/17-Inhibitoren und der ADAM10 Prodomäne konnte ADAM10, aber nicht ADAM17, als Hauptprotease für TIM-2 identifiziert werden. Weitere Experimente zum Shedding von TIM-2 in Wildtyp-, ADAM10-, 17- oder doppelt (ADAM10 und 17)-defizienten MEFs (murinen embryonalen Fibroblasten) bestätigten, dass TIM-2 durch ADAM10 gespalten wird. Interessanterweise führte eine Deletion im extrazellulären Bereich von TIM-2 nahe der Transmembrandomäne zu einer stark verminderten TIM-2-Spaltung nach BzATP- oder Ionomycin-Stimulation. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, dass die ADAM10-Schnittstelle im TIM-2 Protein innerhalb der Region zwischen Prolin221 und Lysin230 liegt oder, dass dieser Bereich essentiell für die Substraterkennung durch ADAM10 ist. Weitere Untersuchungen mit TIM-2 Mutanten ohne die Immunglobulindomäne oder der intrazellulären Region zeigten keinen Einfluss auf das TIM-2 Shedding. Studien an L-Selektin, APP (Amyloid Precursor Protein) oder Semaphorin4D deuten an, dass das Calcium-bindende Protein Calmodulin (CaM) ein negativer Shedding-Regulator ist. Dieses konnte auch hier für das Substrat TIM-2 gezeigt werden, da die Interaktion von TIM-2 mit Calmodulin das Shedding von TIM-2 negativ beeinflusst. CaM interagiert vermutlich mit dem transmembranen-intrazellulären Bereich von TIM-2 und verhindert somit die Prozessierung durch ADAM10. Schließlich konnte die BzATP- und Ionomycin-vermittelte Spaltung von endogenem TIM-2 auf primären murinen B Zellen nach der Aktivierung mit anti-IgM und anti-CD40 monoklonalen Antikörpern nachgewiesen werden. Außerdem war H-Ferritin, der natürliche Ligand von TIM-2, nicht nur in der Lage an das membranständige TIM-2 zu binden, sondern auch an die natürlich, lösliche TIM-2 Variante. H-Ferritin vermittelt den Eisentransport im Organismus und kann die Proliferation von B Zellen steigern. Ob dementsprechend das hier erstmalig beschriebene ADAM10-abhängige Shedding von TIM-2 in der B Zellbiologie oder bei der Regulation der Eisenhomöostasis eine Rolle spielt, müsste in weiteren Studien untersucht werden.

TIM (T cell immunoglobuline and mucin domain) genomic regions are linked to multiple disease states including allergy, asthma, transplant tolerance, autoimmunity and cancer (Freeman et al., 2010). There are eight TIM genes in mice (mTIM-1 - mTIM-8), and three in humans (hTIM-1, hTIM-3, hTIM-4). The murine TIM-2 protein has no ortholog in humans but is highly homologous to the murine TIM-1, which is known to be proteolytically cleaved. Many transmembrane proteins are cleaved from the cell surface by proteases, resulting in the generation of soluble ectodomains, which can regulate different immune processes. TIM-2 is a type I transmembrane glycoprotein and is expressed on late differentiated Th (T helper)2 cells or activated B cells. The structure of the TIM proteins resembles that of fractalkine, which is a membrane bound CX3CL1 chemokine and is cleaved by ADAM10 and ADAM17. Here, ectodomain-shedding of TIM-2 by ADAM10 or 17 was analyzed. The phorbol-ester PMA (Phorbol-12-myristat-13-acetat) was used for the activation of ADAM17 and the ionophor ionomycin or BzATP (2'(3')-O-(4-Benzoylbenzoyl)Adenosin-5'-Triphosphat) were used to induce ADAM10. With the help of ADAM10/17-specific inhibitors and the ADAM10 prodomain, ADAM10 but not ADAM17 was identified as major sheddase of TIM-2. Further shedding experiments with ADAM10-, ADAM17- or double (ADAM10 and 17)-deficient MEFs (murine embryonic fibroblasts) confirmed the cleavage of TIM-2 by ADAM10. Interestingly, ionomycin- or BzATP-induced shedding of TIM-2 was abrogated by deletion of 10 juxtamembrane amino acids from the stalk region but not by deletion of two further N-terminally located blocks of 10 amino acids, indicating a membrane proximal cleavage site within the region between proline221 and lysine230. TIM-2 lacking the immunoglobulin domain or the intracellular tail was cleaved after ionomycin- or BzATP-treatment, indicating that these domains were not involved in the regulation of ectodomain shedding. Studies with L-selectin, APP (Amyloid Precursor Protein) or semaphorin4D defined the basic calcium-binding protein calmodulin (CaM) as a negative shedding-regulator of these substrates. In this study, the same was shown for TIM-2, because TIM-2 cleavage by ADAM10 was enhanced after stimulation with the CaM-inhibitor W7 (N-(6-Aminohexyl)-5-chlor-1-naphthalinsulfonamid). Therefore, it is possible, that the interaction of CaM with the transmembrane-intracellular region of TIM-2 inhibits the ADAM10-mediated shedding of TIM-2. Moreover, BzATP- and Ionomycin-mediated shedding of endogenous TIM-2 was verified in primary murine B cells activated with anti-IgM and anti-CD40 monoclonal antibodies. Furthermore, it was demonstrated, that H-ferritin the natural ligand of TIM-2, interacts with recombinant soluble TIM-2 as well as with shed TIM-2 protein. H-ferritin is involed in the cellular iron-transport and can stimulate the proliferation of B cells. Therefore, further analyses will have to show if the ADAM10-dependent TIM-2 shedding is involved in B cell-biology or iron-homeostasis.

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Dewitz, Christin: Die proteolytische Freisetzung des T Zell Immunglobulin- und Mucindomänen Proteins 2 (TIM-2) ist ADAM10-abhängig und wird durch Calmodulin beeinflusst. 2014.

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