Rhadinovirale Vektoren zum Transfer unter Latenz exprimierter oder induzierbarer Gene in primäre T-Lymphozyten, Hepatozyten und sensorische Neurone und zur Umleitung der T-Zell-Spezifität auf ein Tumorantigen

Bremer, Linda

Herpesvirus saimiri ist ein Rhadinovirus von Neuwelt-Primaten, kann verschiedene humane und nicht humane Zelltypen und Zelllinien infizieren und eignet sich für viele Fragestellungen des viralen Gentransfers. Das virale Genom lag als bakterielles artifizielles Chromosom kloniert vor und konnte dadurch schnell und zielgerichtet manipuliert werden. Die Integrität des klonierten Virusgenoms wurde durch Pyrosequenzierung bestätigt. Verschiedene umfangreiche Fremdgen-Sequenzen wurden in unterschiedliche Bereiche des Virusgenoms eingesetzt. Bei diesen Fremdsequenzen handelte es sich entweder um konstitutiv exprimierte oder um regulierte Gene, die mit dem Tetracyclin-Doppelschalter-System gezielt ein- und ausgeschaltet werden können. Erstens wurde ein chimärer T-Zell-Rezeptor gegen die humane Rezeptortyrosinkinase ErbB2 als konstitutiv während der latenten Persistenz exprimiertes Transgen in das virale Vektorkonstrukt inseriert. ErbB2 ist auf der Zelloberfläche bei vielen Mamma- und Ovarialkarzinomen überexprimiert. Mit dem rekombinanten Virusvektor wurden humane T-Lymphozyten transduziert. Die Expression des chimären T-Zell-Rezeptors und seine starke cytolytische Aktivität auf ErbB2-positive Tumorzellen war langfristig nachweisbar und wurde über ein Jahr untersucht. Zweitens wurden virale Vektoren hergestellt, bei denen die Transgenexpression durch eine Variante des Tetracyclin-Doppelschalters reguliert wird, bei dem die Transregulatoren abhängig vom Alpha-Fetoprotein-Enhancer-Promotor nur in Alpha-Fetoprotein-positiven humanen Hepatomzellen exprimiert werden können. Dies wurde mikroskopisch für das grün fluoreszierende Protein gezeigt, sowie funktionell für die durch tBid induzierte Apoptose. Drittens wurde der Tetracyclin-Doppelschalter in einer Variante erprobt, bei der die Transregulatoren unter Kontrolle des CD2-Enhancer-Promotors standen. Hier war allerdings die Transgenexpression stark eingeschränkt und die induzierte Apoptose nicht nachweisbar. Viertens wurden rhadinovirale Vektoren für das murine Glykoprotein gp130 in konstitutiver und regulierter Variante hergestellt. Diese Vektoren führten bei Hamsterzellen zur Empfindlichkeit auf IL-6 und waren in der Lage, das Neuritenwachstum bei sensorischen Neuronen aus gp130-Defekt-Mäusen zu rekonstituieren. In einem fünften Projektteil wurden neuartige miRNA-Kandidaten des Herpesvirus saimiri identifiziert und auf ihre Prozessierung und Funktion untersucht. Insgesamt konnten somit Herpesvirus-saimiri-Vektoren für den Gentransfer wesentlich weiter entwickelt werden, besonders für die Anwendung zur Umlenkung der T-Zell-Spezifität auf Tumorantigene.

Herpesvirus saimiri is a rhadinovirus of New World primates, is able to infect various human and non-human cell types and cell lines and is useful for many aspects of viral gene transfer. The viral genome was already available as a cloned bacterial artificial chromosome and could be rapidly manipulated in a targeted way. The integrity of the cloned virus genome was confirmed by pyrosequencing. Various extensive foreign gene sequences were inserted in different areas of the virus genome. These foreign sequences were either constitutively expressed or regulated genes, which could be switched on or off using the tetracyclin double-switch system, selectively. First, a chimeric T-cell receptor against the human receptor tyrosine kinase ErbB2 was inserted into the viral vector construct as a constitutively expressed transgene during latent persistence. ErbB2 is overexpressed on the cell surface of many mammary and ovarial carcinomas. Human T lymphocytes were transduced with the recombinant virus vectors. The expression of the chimeric T-cell receptor and its strong cytolytic activity on ErbB2-positive tumor cells was stably detected and was investigated over one year. Secondly, virus vectors were generated, in which transgene expression is regulated by a variant of the tetracyclin double switch in which the transregulators can be expressed dependent on the alpha-fetoprotein enhancer promoter only in alpha-fetoprotein-positive human hepatoma cells. This was shown by microscopy for the green fluorescent protein, as well as functionally for tBid-induced apoptosis. Thirdly, the tetracyclin double switch was tested in a variant in which the transregulators were controlled by the CD2 enhancer promoter. Here, transgene expression was limited and induced apoptosis was not detectable. Fourthly, rhadinoviral vectors for the murine glycoprotein gp130 were generated in constitutive and regulated versions. The vectors induced IL-6 sensitivity in hamster cells and were able to reconstitute neurite growth in sensory neurons of gp130 defect mice. In a fifth project part, novel miRNA candidates of herpesvirus saimiri were identified and investigated concerning their processing and fuction. Taken together, herpesvirus saimiri vectors were considerably further developped, particularly for the redirection of T-cell specificity towards tumor antigens.

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Bremer, Linda: Rhadinovirale Vektoren zum Transfer unter Latenz exprimierter oder induzierbarer Gene in primäre T-Lymphozyten, Hepatozyten und sensorische Neurone und zur Umleitung der T-Zell-Spezifität auf ein Tumorantigen. 2014.

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