Chemische und biochemische Synthesen zur Funktionsuntersuchung von Membranproteinen

Mak, Ellen

Die vorliegende Arbeit besteht aus drei Teilprojekten. Das erste Projekt umfasst die Etablierung der nonsense-Suppression Methode zum Einbau von unnatürlichen Aminosäuren in Proteine. Dafür wurden die beiden Bausteine, das Dinukleotid pdCpa (5’-Phospho-2’-desoxycytidylyl(3’-5’)adenosin) und die verkürzte tRNA(-CA) mit dem amber Anticodon, zur Herstellung der vollständigen, misacylierten tRNA CUAuaa hergestellt. Das Dinukleotid konnte in sieben Stufen synthetisiert werden. Die verkürzte tRNA(-CA) wurde molekularbiologisch über eine run off -Transkription synthetisiert. Des Weiteren wurden die beiden unnatürlichen Aminosäuren 4-Iod-L-phenylalanin und 4-Methoxy-L-phenylalanin geschützt und aktiviert. Erste Versuche zur Veresterung des Dinukleotids mit der unnatürlichen Aminosäuren wurden gemacht. Für die Analyse des Reaktionsgemisches wurde eine HPLC-Methode entwickelt. Die Analyse ergab, dass neben dem einfach aminoacylierten, vermutlich auch das bisaminoacylierte Produkt entstanden war. Das zweite Projekt bestand in der Untersuchung von Amphipolen in der zellfreien Proteinsynthese, welche bereits im Arbeitskreis etabliert ist. Die Amphipole sollen als Alternative zu Detergenzien getestet werden, da sie eine proteinstabilisierende Wirkung haben und eventuell Proteine besser in der nativen Faltung fördern. Daher wurden die kommerziell erhältlichen Amphipole A8-35, PMAL-C8, PMALC12 und C16 im zellfreien System getestet. Die Testung ergab, dass von den vier getesteten Amphipole, nur in PMAL-C8 sowohl GFP als auch das Membranprotein PfAQP-GFP zellfrei hergestellt werden konnte. Es zeigte sich auch, dass eine höhere Konzentration an PMAL-C8 im Ansatz die zellfreie Proteinsynthese nicht stört, wie es bei den anderen drei Amphipolen der Fall war. PMAL-C8 wurde mit Detergenzien aus der Brij-Familie in der zellfreien Synthese verglichen. Dazu wurden unterschiedliche GFP-Fusionsproteine in Brij-Detergenzien und in PMAL-C8 zellfrei hergestellt: Der Formiat-Transporter aus Escherichia coli ecFokA-GFP, der Harnstoff-Transporter B aus der Ratte rUT-B-GFP und der M2-Kanal aus Influenza Virus A M2-GFP. Die Ergebnisse zeigten, dass in PMAL-C8 alle Proteine hergestellt werden konnten und dass die Ausbeute an richtig gefaltetem Protein mit den Brij-Detergenzien vergleichbar war. Eine Verschiebung zu richtig gefaltetem Protein in seiner nativen Form konnte nicht beobachtet werden. PMAL-C8 wurde auch zur präparativen zellfreien Synthese von M2-GFP eingesetzt. Mit Hilfe der Saccharose-Gradienten-Zentrifugation konnte nachgewiesen werden, dass sie auch in Gegenwart von PMAL-C8 eingebaut werden können. Allerdings stört eine erhöhte Konzentration an PMAL-C8 die Bildung von Proteoliposomen. Die Protonenleitfähigkeit des M2-Kanals konnte am SURFE2R nachgewiesen, aber nicht durch Amantadin inhibiert werden, wie es beim M2-Kanal der Fall war, der in einem Brij-Detergenz hergestellt wurde. Das dritte Projekt umfasst die Untersuchung der Pentamidinaufnahme in Trypanosoma brucei. Die Untersuchung wurde am Aquaglyceroporin aus Trypanosomen (TbAQP2) durchgeführt, da postuliert wurde, dass aufgrund des speziellen Selektivitätsfilters von TbAQP2, das Pentamidin den Kanal direkt passieren kann. In einer Voruntersuchung konnte festgestellt werden, dass Pentamidin den Kanal nicht passiert, sondern inhibiert. Die Pentamidin-Analoga 4-n-Propoxybenzamidin und 4-n-Pentoxybenzamidin wurden eigens für die Untersuchung synthetisiert. Die Ergebnisse zeigten, dass ionische und hydrophobe Wechselwirkungen des Pentamidins mit TbAQP2 für die starke Bindung verantwortlich sind. Um die Pentamidinaufnahme visuell in Zellen verfolgen zu können, wurden basierend auf den Ergebnissen fluoreszierende Pentamidin-Analoga mit Fluorescein und Cumarin als Fluorophore entworfen. Die Vorstufen zur Synthese der Cumarin- und Fluorescein-Pentamidin-Analoga konnten erfolgreich synthetisiert werden. Massenspekrometrische Analysen der Reaktionsgemische zur Synthese der Cumarin-Pentamidin-Analoga zeigten einen Umsatz zum Produkt, wobei die Synthesen noch weiter optimiert werden müssen. In der Synthese des Fluorescein-Pentamidin-Analogon mit einer Etherverknüpfung zeigte sich, dass die Amidinfunktion mit der Carboxylgruppe zum Acylamidin reagierte. Das Fluorescein-Pentamidin-Analogon mit einer Esterverknüpfung konnte erfolgreich synthetisiert werden.

This work consists of three projects. The first project was to establish the nonsense suppression method for the incorporation of unnatural amino acids into proteins. Therefore, the two components pdCpA (5’-phospho-2’-deoxycytidylyl(3’-5’)adenosine) and the truncated tRNA(-CA) with the amber anticodon were synthesized. The dinucleotide pdCpA was synthesized in seven steps. The truncated tRNA(-CA) was prepared by run off transcription. For the esterification with pdCpA, the unnatural amino acids 4-iodo-L-phenylalanine and 4-methoxy-l-phenylalanine were activated and protected. The progress of the esterification can be monitored by reverse phase HPLC. For this purpose a HPLC method were developed. The second project was to test commercially available amphipols in the cell-free expression system, which is already established in this work group. A8-35, PMALC8, PMAL-C12 and PMAL-C16 were tested as alternatives to detergents, because of their protein stabilizing properties. Cell-free expression of GFP and Pf AQP was only possible in PMAL-C8, even at higher concentrations there was no sign of inhibition. PMAL-C8 and detergents of the Brij family were compared in the cell-free synthesis of different membrane proteins: the formate-transporter of Escherichia coli ecFokA, the urea-transporter B from rat rUT-B and the M2 proton channel of the influenza A virus. All membrane proteins were C-terminal GFP-fusion proteins, where GFP can indicate the folding state. As a result, all membrane proteins were synthesized in the presence of PMAL-C8. There was no difference in the protein yield, whether the membrane proteins were synthesized in PMAL-C8 or in Brij detergents. M2-GFP was also produced at preparative scale in the presence of PMAL-C8. The formation of proteoliposomes were determined by sucrose gradient centrifugation, however, higher concentrations of PMAL-C8 seem to inhibit the formation of proteoliposomes. Proton conductance of M2-GFP was measured, but compared to M2-GFP expressed in the presence of Brij78, it could not be inhibited with amantadine. The third project was to provide tools for studying the mechanism of pentamidine uptake in Trypanosoma brucei. AQP2-specific gene knockout generated pentamidine resistance. Therefore the group of D. Horn proposed the direct passage of pentamidine via TbAQP2, because of their unusual selectivity filter. However our preliminary investigation showed full inhibition of TbAQP2 by pentamidine. To investigate which structure properties were important for the inhibition of TbAQP2, the pentamidine analogues 4-n-propoxybenzamidine und 4-n-pentoxybenzamidine were synthesized. According to the results ionic and hydrophobic interactions were responsible for the binding. In order to visualize the uptake of pentamidine in trypanosomes, fluorescent pentamidine analogues with fluorescein and coumarin as fluorophores were designed. Synthesis of the precursors of the fluorescein- and coumarin-pentamidine-analogues were successfull with appropriate yields. Mass spectra analysis provided evidence for the chemical reaction to have yielded the coumarin-pentamidine-analogues, but the reactions need further optimization. There was a side reaction to an acylamidine during the synthesis of the fluorescein-pentamidine-analogue with the ether bond. However, the fluorescein-pentamidine-analogue with an ester bond was successfully synthesized.

Cite

Citation style:

Mak, Ellen: Chemische und biochemische Synthesen zur Funktionsuntersuchung von Membranproteinen. 2014.

Rights

Use and reproduction:
No CC License (german copyright law applies)

Export