Biophysical Studies of Processes Involved in Acanthamoeba Infections : Contact Lens Contamination, Adhesion, and Intracellular Dynamics

Reverey, Julia Franziska

Acanthamoeba castellanii can cause a severe and painful, acanthamoeba keratitis. In this disease, the acanthamoebae reach the eye via contaminated contact lenses. In the eye, they invade cornea cells and kill them. The first step in this process is the formation of a close contact between the acanthamoeba and the target-cell. This contact is mainly mediated by mannose. Subsequently, cytolytic factors move to the contact site and are released leading to the death of the target-cell. The single steps involved in the infection pathway, namely contact lens contamination, carbohydrate-mediated acanthamoeba adhesion, and intracellular transport were investigated in this thesis. As the use of contact lenses is a main risk factor in the infection process, in the first part of this thesis different silicone hydrogel and hydrogel materials were investigated for their potential to be contaminated with A. castellanii. Furthermore, influences of standard contact lens cleaning procedures on the adhesion and proliferation of A. castellanii were evaluated. It was observed that A. castellanii preferentially adhered to lenses with high water content (>60 %). Furthermore, while multipurpose and peroxide solution reduced adhesion of acanthamoeba significantly, only the peroxide solution was able to kill all A. castellanii effectively. If contaminated contact lenses are inserted into the eye, acanthamoebae reach the cornea, move through the epithelial tissue of the cornea and kill target-cells in the underlying cell layers. Thus, in the second part of this thesis interactions of acanthamoebae with proteins in the extracellular matrix, as well as the carbohydrate-mediated adhesion to target-cells were investigated. In order to mimic the extracellular matrix, glass slides were coated with proteins and the number of adhering acanthamoebae was evaluated. Compared to the glass, increased adhesion was observed on matrigel followed by fibronectin. This increase in number of adhering acanthamoeba was presumably mediated by mannose present in the protein coatings. In order to investigate the initial adhesion of acanthamoebae to target-cells, quasi-hexagonally arranged patterns of gold nanodots with different interparticle distances were produced by diblock copolymer micelle nanolithography and functionalized with mannose or glucose, respectively. By passivating the areas between the dots with polyethylene glycol (PEG), unspecific adhesion of the acanthamoebae in the inter-particle space was reduced and therefore only the biofunctionalized gold dots served as anchoring points for the adhesion. The evaluation of the number and the spreading area of A. castellanii showed that already relatively low densities of mannose lead to stable adhesion of the acanthamoebae and that mannose as single ligand is sufficient for adhesion. In order to quantify forces of the binding of A. castellanii to carbohydrate-functionalized surfaces, force spectroscopic measurements were carried out by atomic force microscopy (AFM). The measurements showed that with increasing contact time of acantameobae to mannose coated AFM cantilevers the maximum adhesion force and the adhesion energy increase. After initial adhesion of acanthamoeba to the target-cell, cytolytic factors, move to the contact site, are released and lead to target-cell death. Thus intracellular transport of vesicles was investigated in the last part of this thesis. In order to examine the intracellular dynamics, the transport processes of particles inside acanthamoebae were evaluated and compared after addition of filament depolymerizing substances and molecular-motor inhibiting substances. The intracellular space in A. castellanii is extremely crowded, and most particles were moving actively. This was also the case after the different treatments, which inhibited the motion of the whole amoebae, but not of the intracellular particles.

Acanthamoeba castellanii können eine schmerzhafte, das Sehvermögen beeinträchtigende Acanthamöbenkeratitis verursachen. Dabei gelangen die Acanthamöben häufig über kontaminierte Kontaktlinsen oder Kontaktlinsenbehälter in das Auge. Dort dringen sie in die Hornhaut ein und töten Zielzellen ab. Dieser Mechanismus wird über die Ausbildung eines engen Kontakts zur Zielzelle initiiert. Die Kontaktbildung selbst wird hauptsächlich durch das Kohlenhydrat Mannose vermittelt. Nach Kontaktbildung bewegen sich zytolytische Faktoren in der Amöbe zur Kontaktstelle und werden dort freigegeben. Dies führt zum Tod der Zielzelle. In dieser Arbeit wurden drei relevante Phasen der Infektion untersucht: Kontamination von Kontaktlinsen mit Amöben, Kohlenhydrat-basierte Kontaktbildung zwischen Acanthamöbe und Zielzelle, sowie intrazellulärer Transport. Da Kontaktlinsen einen Hauptrisikofaktor in der Infektion darstellen, wurden im ersten Teil dieser Arbeit verschiedene Kontaktlinsenmaterialien (Siliconhydrogele sowie Hydrogele) auf ihr Kontaminationspotential untersucht. Zudem wurde der Einfluss von gängigen Reinigungsmethoden auf die Anhaftung und das Überleben der Acanthamöbe geprüft. Es zeigte sich, dass A. castellanii bevorzugt an Kontaktlinsen mit hohem Wassergehalt haften (> 60 %). Sowohl Pflegelösung als auch Peroxidlösung reduzierten die Adhäsion der Acanthamöben, wobei jedoch nur die Peroxidlösung die Zellen vollständig abtötete. Werden kontaminierte Kontaktlinsen ins Auge eingesetzt, erreichen die Amöben die Hornhaut, durchdringen das Epithelgewebe und töten Zellen in den darunterliegenden Zellschichten ab. Daher wurden im zweiten Teil Wechselwirkungen zwischen Acanthamöben und extrazellulärer Matrix, sowie die durch Kohlenhydrate vermittelte Anhaftung von Acanthamöben an Zielzellen untersucht. Um die extrazelluläre Matrix zu imitieren, wurden Deckgläser mit Proteinen beschichtet und die Anzahl anhaftender Acanthamöben bestimmt. Der Vergleich zur unbeschichteten Kontrolle ergab eine erhöhte Adhäsion von Acanthamöben auf Matrigel gefolgt von Fibronektin. Zur Untersuchung der initialen Anhaftung von Acanthamöben an Zielzellen, wurden Substrate mit quasi-hexagonal angeordneten Goldnanopunkten mit unterschiedlichen Abständen hergestellt und mit Mannose bzw. Glucose funktionalisiert. Unspezifische Anhaftung der Acanthamöben zwischen Goldpunkten wurde durch Passivierung dieser Bereiche mit Polyethylenglykol (PEG) verhindert, sodass ausschließlich funktionalisierte Goldpunkte als Haftstellen für Acanthamöben dienten. Die Analyse von Zellzahl und Zellfläche ergaben, dass bereits geringe Dichten des Kohlehydrats Mannose zu stabiler Adhäsion der Acanthamöben führten, wobei Mannose als einzelner Ligand ausreichte. Das kurzzeitige Anhaftungsverhalten an Kohlenhydrat-beschichtete Oberflächen sowie die Adhäsionskraft von Acanthamöben wurden erstmals mittels kraftspektroskopischer Untersuchungen am Rasterkraftmikroskop (AFM) quantifiziert. Die Messungen ergaben eine deutliche Zunahme von maximaler Adhäsionskraft und Adhäsionsenergie mit ansteigender Kontaktzeit zwischen Acanthamöbe und Mannose-beschichteter Oberfläche. Das initiale Anhaften der Acanthamöbe an die Zielzelle bewirkt eine Migration von in Vesikeln eingeschlossenen zytolytischen Faktoren zur Kontaktstelle. Daher wurde im letzten Teil dieser Arbeit der intrazelluläre Transport von Vesikeln näher untersucht. Dazu wurden Vesikeltrajektorien analysiert und einzelne zelluläre Transportstrukturen gezielt mittels Zugabe von Filament-depolymerisierenden Substanzen sowie Substanzen zur Inaktivierung molekularer Motoren gestört. Es wurden überwiegend aktive Bewegungen von intrazellulären Vesikeln beobachtet. Die verschiedenen Substanzen stoppten zwar nahezu die Bewegung der gesamten Zellen, inhibierten jedoch nicht den Transport der Vesikel in der Acanthamöbe.

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Reverey, Julia Franziska: Biophysical Studies of Processes Involved in Acanthamoeba Infections : Contact Lens Contamination, Adhesion, and Intracellular Dynamics.

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