Regulation of Lipoprotein(a) by interleukin-6 in humans

Müller, Nike

Cardiovascular disease is still the leading cause of death in the western world in men and women. There are several factors such as visceral obesity, hypertension, insulin resistance and atherogenic dyslipidemia which substantially contribute to a risk of cardiovascular death. Low-density lipoprotein (LDL) molecules initiate early atherogenesis. One of the most atherogenic lipoproteins is lipoprotein(a) [Lp(a)], which consists of a LDL-like particle and apolipoprotein(a) [apo(a)]. However, circulating levels of Lp(a) are remarkably resistant to common lipid lowering therapies. One exception to effectively lower Lp(a) levels is niacin. However, due to severe side effects, niacin was recently withdrawn from the market in Europe. Thus, there are currently no effective treatments available for the reduction of Lp(a) apart from lipid aphaeresis which is costly and labor-intensive. For this reason, alternative well-tolerated and more convenient therapeutic approaches are required to decrease elevated Lp(a) serum levels. In a recent clinical study it was shown that inhibition of interleukin-6 (IL-6) signaling by tocilizumab (TCZ) lowers Lp(a) serum levels in rheumatoid arthritis (RA) patients by up to 50 %. Therefore, one may consider TCZ as a new promising approach for lowering Lp(a). In order to prove for causality and to exclude possible confounders within the clinical study this thesis aims to further examine the ability of IL-6 to induce hepatic apo(a) expression and the ability of TCZ to inhibit apo(a) on a molecular level in humans in vitro and in vivo. To address this question, molecular, cellular and physiological experiments as well as human association studies were combined to analyze regulatory determinants of Lp(a) in humans. In the present thesis it was shown that the Lp(a) lowering effect of TCZ is specific to IL-6 signaling as anti-TNF-α therapy did not alter Lp(a) serum levels in RA patients. Moreover, significant associations between determinants such as IL-6, C-reactive protein (CRP), Body Mass Index as well as homeostasis model assessment-estimated insulin resistance and Lp(a) in n=1153 human subjects were found. Amongst those, IL-6 and IL-6 response reactant CRP were strongest associated with Lp(a). Mechanistic cell culture studies on IL-6 and apo(a) revealed that IL-6 specifically induced apo(a) and that TCZ inhibited the IL-6-induced apo(a) expression on promoter, transcript and protein level in cultured hepatocytes. As it is known that the apo(a) promoter contains six IL-6 responsive elements (RE), the apo(a) promoter was truncated to explicitly investigate which IL-6 RE(s) is/are responsible for the apo(a) transcription. This analysis suggested that solely IL-6 RE 6 confers major apo(a) transcription. IL-6-dependent binding of transcription factor STAT3 to IL-6 RE was verified in subsequent EMSA experiments. In addition, not only apo(a) but also LDL metabolism were demonstrated to be affected by IL-6 and TCZ. In conclusion, the present thesis provides several lines of evidence that (1) IL-6 specifically induces apo(a) and eventually Lp(a) on different molecular levels in vivo and in vitro and that therefore (2) IL-6 blockade by TCZ might be a promising future therapy to treat elevated Lp(a) serum levels and to reduce CVD risk in affected patients. Hence, TCZ might be a convenient alternative to the costly, labor-intensive and invasive lipid aphaeresis.

Kardiovaskuläre Erkrankungen sind immer noch die führende Todesursache bei Frauen und Männern in der westlichen Welt. Es gibt verschiedene Faktoren wie viszerale Adipositas, Hypertonie, Insulinresistenz und atherogene Dyslipidämie, welche zum Risiko des kardiovaskulären Todes substantiell beitragen. Low density lipoprotein (LDL) Moleküle initiieren die frühe Atherogenese. Eines der atherogensten Lipoproteine ist Lipoprotein(a) [Lp(a)], das aus einem LDL-ähnlichem Partikel und dem Apolipoprotein(a) [Apo(a)] besteht. Zirkulierende Lp(a) Serumspiegel jedoch sind bemerkenswerterweise gegen gewöhnliche lipidsenkende Therapien eher resistent. Eine Ausnahme ist Niazin, welches erhöhte Lp(a) Serumspiegel effektiv senken kann. Aufgrund von schweren Nebenwirkungen wurde Niazin allerdings in Europa bereits im letzten Jahr vom Markt genommen. Somit sind derzeit neben der sehr kostenintensiven, aufwändigen und zudem noch invasiven Lipid-Aphärese keine effektiven Therapiemöglichkeiten für die Reduktion von Lp(a) verfügbar. Aus diesem Grund werden alternative gut verträgliche und geeignete Therapieansätze benötigt, um erhöhte Lp(a) Serumspiegel zu senken. In einer jüngsten klinischen Studie wurde gezeigt, dass die Inhibition des Interleukin-6 (IL-6) Signalweges durch Tocilizumab (TCZ) die Lp(a) Serumspiegel in Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) bis zu 50% erniedrigt. Folglich könnte man davon ausgehen, dass TCZ als neuer, erfolgversprechender Ansatz für die Behandlung von erhöhtem Lp(a) betrachtet werden kann. Um auf Kausalität zu prüfen und mögliche Störfaktoren innerhalb der klinischen Studie zu exkludieren, intendierte diese Arbeit, die Apo(a)-induzierende Fähigkeit von IL-6 und die Apo(a)-inhibierende Fähigkeit von TCZ auf molekularer Ebene im humanen Model in vivo und in vitro weiter zu untersuchen. Um diese Fragestellung zu bearbeiten, wurden molekulare, zelluläre und physiologische Experimente sowie auch Assoziationsstudien kombiniert, um regulatorische Determinanten von Lp(a) im Menschen zu analysieren. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass der Lp(a)-reduzierende Effekt durch TCZ spezifisch für IL-6 ist, da eine anti-TNF-α Therapie die Lp(a) Serumspiegel in RA Patienten nicht veränderte. Weiterhin wurden signifikante Assoziationen zwischen Determinanten wie IL-6, dem C-reaktivem Protein (CRP), dem Body Mass Index sowie auch dem Insulinresistenz-Index (HOMA) und Lp(a) in 1153 Probanden gefunden. Unter diesen waren IL-6 und Akut-Phase-Protein CRP am stärksten mit Lp(a) assoziiert. Mechanistische Zellkulturstudien zu IL-6 und Apo(a) bestätigten, dass IL-6 Apo(a) spezifisch induziert, und dass TCZ die IL-6-induzierte Apo(a) Expression auf Promoter, Transkript und Proteinebene in kultivierten Hepatozyten aufhebt. Da bekannt ist, dass der Promoter des Apo(a)-Gens sechs IL-6 responsive Elemente (IL-6-RE) besitzt, wurde der Apo(a) Promoter trunkiert, um explizit zu untersuchen, welche/s der sechs IL-6-RE für die Apo(a) Transkription verantwortlich ist/sind. Hierbei ergab sich, dass hauptsächlich IL-6-RE 6 die Apo(a) Transkription reguliert. Die IL-6-abhängige Bindung des Transkriptionsfaktors STAT3 an IL-6-RE 6 wurde ebenfalls in einem nachfolgenden EMSA Experiment verifiziert. Zusätzlich wurde demonstriert, dass nicht nur der Apo(a), sondern auch der LDL Metabolismus durch IL-6 und TCZ beeinflusst wird. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit zahlreiche Beweise liefert, dass (1) IL-6 spezifisch Apo(a) und letztlich Lp(a) auf verschiedenen molekularen Ebenen in vivo und in vitro induziert und dass dadurch (2) eine IL-6 Rezeptor Blockierung durch TCZ eine vielversprechende zukünftige Therapieoption sein kann, um erhöhte Lp(a) Serumspiegel zu behandeln und um das kardiovaskuläre Risiko in betroffenen Patienten zu reduzieren. TCZ würde daraus folgend eine geeignete Alternative zur aufwendigen Lipid-Aphärese darstellen.

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Müller, Nike: Regulation of Lipoprotein(a) by interleukin-6 in humans. 2014.

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