Functional characterization of NLRC3

Bremer, Lars

The innate immune system relies on several pattern recognition receptors (PRRs) to identify pathogen associated molecular patterns (PAMPs). One of the most prominent non-clonal, germline encoded but yet not fully characterized PRR group are the NOD-like receptors (NLRs). Here I aim to characterize a hitherto rarely described member of the NLRs named NOD-like receptor CARD domain containing 3 (NLRC3). Recent studies indicated, that NLRC3 is a cytosolic receptor which negatively regulates T cell function. This thesis utilizes several experimental approaches to access the cellular localization of NLRC3, its functional interactions, and role in inflamed tissue. Microscopical studies showed, that NLRC3 is localized in the cytoplasm. Analysis of different organs indicated, that NLRC3 transcript level are elevated in immune relevant tissues, but not in the intestinal tract. A Y2H screen indicated a potential interaction with the mitochondrial protein IMMT/Mitofilin. Although a direct interaction remained elusive, NLRC was detected in close spatial proximity of mitochondria via immunefluorescence and identified in mitochondrial lysates. NLRC3 was found to interfere with NFB signaling in a dose dependent manner. Dual luciferase assays were performed revealing connections to TRAF6 and ERSE. NLRC3 seems to negatively regulate the TRAF6 mediated NFB response. In combination with a potent stressor, such as tunicamycin elevates NLRC3 the ERSE promoter activity. This reaction connects NLRC3 to cellular mechanisms of the unfolded protein response, and subsequently to mitochondrial stress reactions. NLRC3 was found to be downregulated in biopsies of WG patients. During this thesis Nlrc3+/+ and Nlrc3-/- mice were bred and utilized in several experiments. Cytokine level in bone marrow derived macrophages varied between Nlrc3+/+ and Nlrc3-/- in response to LPS stimulation. A DSS induced colitis was conducted and revealed, that NLRC3 seems to be beneficial for survival and disease severity. These experiments significantly enlarged the knowledge about NLRC3, pointing at the protective role of NLRC3 during cellular stress response and inflammation. NLRC3 is an important regulator in immune modulation.

Das angeborene Immunsystem basiert auf einer Vielzahl von Mustererkennenden Rezeptoren (PRR, von engl. pattern recognition receptors) zur Identifikation molekularer pathogenassoziierter Muster. Eine der bekanntesten nicht-klonalen, keimbahn-kodierten, jedoch noch unvollständig beschriebene PRR-Gruppe sind die NOD ähnlichen Rezeptoren (NLR, von engl. NODlike receptors). Diese Arbeit hat die Charakterisierung eines bisher kaum beschrieben Mitglieds der NLRs, dem Protein NLRC3 zum Ziel. Bisherige Studien zeigen, dass NLRC3 ein zytosolischer Rezeptor ist, der einen negativ-regulatorischen Einfluss auf T-Zellen aufweist. Im Verlauf dieser Arbeit wurden unterschiedliche experimentelle Ansätze verwendet, um die zelluläre Lokalisation von NLRC3, seine funktionellen Interaktionen, sowie die Rolle in entzündetem Gewebe zu charakterisieren. Mikroskopische Studien konnten zeigen, dass NLRC3 im Zytoplasma verortet ist. Die Untersuchung verschiedener Gewebe ergab dabei, dass sich NLRC3 hauptsächlich in immunrelevanten Geweben, nicht jedoch im Gastrointestinaltrakt nachweisen lies. Nachdem ein Hefe-2-Hybrid Experiment das mitochondriale Protein IMMT/Mitofilin als potentiellen Interaktionspartner für NLRC3 gezeigt hatte, konnte NLRC3 durch Immunfluoreszenzanalysen in unmittelbarer Nähe von Mitochondrien detektiert werden. Zudem gelang die Identifikation von NLRC3 in Mitochondrienlysaten. Der Einfluss von NLRC3 auf den NFB Signalweg ist dosisabhängig und konnte mittels Luziferase-Test auch im Zusammenhang mit TRAF6 und ERSE gezeigt werden. NLRC3 scheint die TRAF6 vermittelte NFB Antwort negativ zu regulieren. In Kombination mit Tunicamycin führte NLRC3 zu einer erhöhten ERSE Promotoraktivität. Diese Ergebnisse bringen NLRC3 in Zusammenhang mit den zellulären Mechanismen der Antwort auf Proteinfehlfaltung und damit schließlich zu mitochondrialen Stressreaktionen. Zudem konnte gezeigt werden, dass NLRC3 in WG Patienten herab reguliert ist. Für diese Arbeit wurden zusätzlich Nlrc3+/+ und Nlrc3-/- Mäuse gezüchtet und in verschiedenen Experimenten untersucht. Die Zytokinspiegel in Makrophagen des murinen Knochenmarks unterschieden sich zwischen den beiden Genotypen nach Stimulation mit LPS. In einer DSS induzierten Kolitis konnte gezeigt werden, dass sich NLRC3 in Bezug auf Überlebensrate und Schwere der Krankheit positiv auswirkte. Die vorliegenden Experimente erweitern deutlich das bisherige Wissen über NLRC3. Die protektive Wirkung von NLRC3 während Zellstress und Entzündung stellt einen bisher unbekannten Aspekt des Wirkspektrums dar. NLRC3 ist dabei ein wichtiger Regulator der Immunmodulation.

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Bremer, Lars: Functional characterization of NLRC3. 2014.

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