Charakterisierung der Serin-Protease-Inhibitoren SPINK9 und SPINK6

Sperrhacke, Maria

Für die Homöostase der Haut ist das Gleichgewicht zwischen Proliferation, Differenzierung und Desquamation essentiell. Die Desquamation findet durch die proteolytische Spaltung der Korneo¬desmosomen durch Kallikreine statt. Deren Aktivität wird unter Anderem durch Serin-Protease-Inhibitoren wie hLEKTI1 reguliert. Kürzlich wurden zwei Homologe zu hLEKTI1, hSPINK9 und hSPINK6 beschrieben. hSPINK6 hemmt selektiv die Kallikreine KLK5, KLK7, KLK12, KLK13 und KLK14, welche wichtig für die Hauthomöostase sind und wird in verschiedenen Hautarealen exprimiert. hSPINK9 hingegen inhibiert nur spezifisch KLK5, ist nur in palmoplantaren Hautbereichen nachzuweisen und hat eine antimikrobielle Aktivität. In der vorliegenden Arbeit wurden diese Serin-Protease-Inhibitoren hSPINK9 und hSPINK6 näher charakterisiert. Es konnte mittels mRNA-Analyse gezeigt werden, dass die Expression beider Inhibitoren induzierbar ist. Des Weiteren konnte nachgewiesen werden, dass sie in der Zelle vesikulär vorliegen und sowohl konstitutiv als auch stimulierbar sekretiert werden. Für das Gleichgewicht zwischen Proliferation und Differenzierung ist die MAPK-Kaskade für die Hauthomöostase ein wichtiger regulatorischer Bestandteil. Dieser Signalweg wird dabei hauptsächlich durch MAPK-Signalweges hauptsächlich durch den epidermal growth factor receptor (EGFR) vermittelt. Die Liganden des EGFR werden duch die ADAM-Metallproteasen freigesetzt, sodass die Regulation der ADAM-vermittelten Proteolyse ebenfalls für die Homöstase der Haut eine wichtige Komponente ist. Interessanterweise haben hSPINK9 und hSPINK6 strukturelle Ähnlichkeiten zu kationischen antimikrobiellen Peptiden (AMPs). Zwei Vertreter der AMPs, LL-37 und Melittin, sind in der Lage die Keratinozytenmigration zu fördern indem sie den EGFR durch eine gesteigerte ADAMs-vermittelte Proteolyse aktivieren. In vitro Wund¬heilungsversuche und Western Blots zeigten, dass auch hSPINK9 die Migration von Keratinozyten induziert indem der EGFR transaktiviert wird. Durch den Einsatz des Breitband-Metalloprotease-Inhibitors Mariamastat und des EGFR-blockiernden Antikörpers Cetuximab konnte nachgewiesen werden, dass eine gesteigerte ADAM-vermittelte Proteolyse der EGFR-Liganden zur Transaktivierung führt. Die klassischen P2-Rezeptoren-Antagonisten oxATP und PPADS blockierten die durch hSPINK9 ausgelöste EGFR-Aktivierung analog zu den kürzlich publizierten Erkenntnissen von LL 37 und Melittin. Dies lässt schlussfolgern, dass P2-Rezeptoren womöglich eine essentielle vermittelnde Funktion bei der Regulation der ADAM-vermittelten Proteolyse durch kationische AMPs spielt. Weitere Untersuchungen deuten daraufhin, dass hSPINK9 genauso wie andere kationische AMPs auch immunmodulatorisch wirkt. Es ist beispielsweise in der Lage, PBMCs anzulocken, indem es die Motilität der Zellen steigert und wird von Eosinophilen exprimiert. Erste Ergebnisse weisen daraufhin, dass hSPINK9 mit eosinophil extracellular traps freigesetzt wird und bei der Verteidigung gegen Bakterien und Parasiten involviert ist. Zusammenfassend hat diese Arbeit gezeigt, dass hSPINK9 neben der spezifischen Inhibition von KLK5 und der antimikrobiellen Aktivität weitere Funktionen besitzt. Durch die migrationsfördende und immunmodulatorische Wirkung als auch die regulatorische Rolle gegenüber der ADAM-vermittelten Proteolyse, kann hSPINK9 eine neue Perspektive zur Behandlung von Wunden und Hautbarriere¬störungen darstellen.

The balance between proliferation, differentiation and desquamation is essential to maintain the skin homeostasis. The desquamation of the uppermost layers of the epidermis is mediated by kallikreins which proteolytically cleave the corneodesmosomes. These kallikreins are regulated inter alia by serine protease inhibitors like hLEKTI1. Recently, two homologs of hLEKTI1, namely hSPINK9 and hSPINK6, were described. hSPINK6 selectively inhibits the kallikreins KLK5, KLK7, KLK12, KLK13 and KLK14 and is expressed in various skin areas. In contrast, hSPINK9 is only expressed in palmoplantar skin and specifically inhibits KLK5. Furthermore it is proposed to be antimicrobially active against E. coli. In this study hSPINK9 and hSPINK6 were further characterized. mRNA analyses showed, that the expression of both inhibitors are inducible. Furthermore, hSPINK9 and hSPINK6 were found to be intracellularly localized in vesicles and are constitutive as well as inducible released. The MAPK cascade is responsible for the regulation of proliferation and differentiation in skin homeostasis. This signalling pathway is mediated by the activation of the epidermal growth factor receptor (EGFR). The ligands of the EGFR are shed by ADAM metalloproteases. Thus the regulation of ADAMs is an important component for the skin homeostasis. Interestingly, hSPINK9 and hSPINK6 have structural similarties to cationic antimicrobial peptides (AMPs). Recently, it was reported that the two AMPs LL 37 and melittin promote keratinocyte migration via activating ADAMs. In vitro wound healing assays and western blots showed that also hSPINK9 transactivates the EGFR resutling in cell migration. The increase in ADAM-mediated proteolysis by hSPINK9 was evidenced by suppression with the broad range metalloprotease inhibitor marimastat and the EGFR-blocking antibody Cetuximab. The classical purinergic receptor antagonists oxATP and PPADS effectively inhibited EGFR-transactivation by rSPINK9, indicating that in analogy to what has recently been reported for the AMPs LL 37 and melittin, purinergic receptors play an essential bridging role in promoting the upregulation of ADAM-function by the cationic peptide. Additional analyses indicated that hSPINK9, just like other cationic AMPs has an immunmodulatory function such as attracting PBMCs via increasing cell motility. Moreover it is expressed in eosinophil granulocytes. Preliminary data showed that hSPINK9 is released with eosinophil extracellular traps and might thus be involved in the defence against bacteria and parasites. Taken together, hSPINK9 has further functions besides its inhibition of KLK5 and its antimicrobial activity. As demonstrated by this work hSPINK9 can function as immunmodulator, migration promotor and trigger of ADAM-mediated transsignalling of the EGF receptor. Therefore it might support wound healing or skin barrier disorders.

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Sperrhacke, Maria: Charakterisierung der Serin-Protease-Inhibitoren SPINK9 und SPINK6. 2014.

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