Charakterisierung des Heme-Responsive Gene 1-Proteins (HRG-1) als Interaktionspartner des Lysosomal-Assoziierten Membranproteins Typ 2 (LAMP-2)

Allerding, Mirka

Das lysosomal-assoziierte Membranprotein 2 (LAMP-2) ist eines der häufigsten Membranproteine des Lysosoms und Mutationen in LAMP-2 sind mit der Danon Erkrankung assoziiert, welche sich durch eine Kardio- und Skelettmuskelmyopathie und geistige Retardierungen auszeichnet. In dieser Arbeit wurden mittels Split-Ubiquitin Yeast Two-Hybrid Screens neue Interaktionspartner für LAMP-2 gesucht. Hierbei wurde der Hämexporter HRG-1 (heme-responsive gene 1) identifiziert, dessen Interaktion nach transienter Expression auch in humanen Zellen validiert werden konnte. Im Zuge einer Charakterisierung des Membranproteins HRG-1 als Interaktionspartner von LAMP-2 konnte die zytoplasmatische Lokalisation des N-Terminus von HRG-1 belegt werden. Des Weiteren konnte eine proteolytische Prozessierung des N-Terminus nach Überexpression in eukaryotischen Zellen gezeigt und die hierfür verantwortlichen Enzyme auf Cysteinproteasen eingegrenzt werden. In mikroskopischen Untersuchungen wurde die spät endosomale und lysosomale Lokalisation von endogenem HRG-1 in eukaryotischen Zellen bewiesen. Zudem konnte in murinen Wildtyp und LAMP-2 Knockout Fibroblasten gezeigt werden, dass LAMP-2 keinen offensichtlichen Einfluss auf die Lokalisation von HRG-1 hat. Weiterhin konnte unter Verwendung von Alaninmutanten ausgeschlossen werden, dass ein Tyrosin- und auch ein Di-Leucin-basiertes putatives Sortierungsmotiv im C-Terminus von HRG-1 für dessen lysosomale Lokalisation beteiligt ist. Durch den Vergleich von Wildtyp und LAMP-2 Knockout Organlysaten konnte eine geringere HRG-1 Proteinkonzentration in LAMP-2 Knockout Geweben detektiert werden, welche jedoch nicht durch eine transkriptionelle Herabregulation der HRG-1 mRNA begründet zu sein scheint. Die Funktion von HRG-1 als Hämexporter wurde in den retikuloendothelialen Zellen der Milz näher untersucht. Hierbei konnte in Milzen von LAMP-2 Knockout Tieren eine Infiltration durch CD68+ Gewebemakrophagen und, mit zunehmendem Alter, eine Akkumulation von Eisen (Fe3+) in diesen Zellen beobachtet werden. Gleichfalls waren sowohl der HRG-1- als auch der Hämoxygenase-1 (HO-1) Gehalt in den Gewebemakrophagen aus LAMP-2-defizienten Mäusen erhöht. Ein Zusammenhang zwischen einer gestörten autophagozytotischen Degradation der intrazellulären Eisenspeicherproteine (Ferritin) und den für die Danon Erkrankung typischen autophagozytotischen Vesikeln wird postuliert. Die Akkumulation von Eisen in den LAMP-2 Knockout Milzen ist zusätzlich von Veränderungen der Erythropoese begleitet, was für eine verminderte Eisenrückgewinnung spricht. Zuletzt konnte durch Untersuchungen der Erythrophagozytose ein Anstieg von HRG-1 und LAMP-1 in der Erythrophagolysosomenmembran von LAMP-2 Knockout Makrophagen gegenüber dem Wildtyp gezeigt werden. Zusammenfassend konnte durch diese Studie HRG-1 als neuer Interaktionspartner von LAMP-2 identifiziert und Veränderungen im Eisenhaushalt von LAMP-2-defizienten Mäusen aufgedeckt werden.

The lysosome-associated membrane protein-2 (LAMP-2) was described as one of the most abundant membrane proteins of the lysosome. Mutations in LAMP-2 are associated with Danon disease, which is characterized by cardiomyopathy, myopathy and mental retardation. In this study split-ubiquitine yeast two-hybrid screens were used to identify novel interaction partners of LAMP-2. Thereby an interaction between the heme exporter HRG-1 (heme-responsive gene 1) and LAMP-2 could be revealed and further validated after transient expression in human cells. By characterizing this interaction the cytosolic localization of the N-terminus of HRG-1 was proven. In addition, a proteolytic cleavage of the N-terminus was observed after overexpression in eukaryotic cells and the responsible enzymes could be narrowed down to cysteine proteases. Microscopic analysis demonstrated the late endosomal and lysosomal localization of endogenous HRG-1 in eukaryotic cells. Using murine wild-type and LAMP-2 knockout fibroblasts no obvious effect of LAMP-2 on the localization of HRG-1 could be observed. Furthermore, alanine mutants showed that neither the tyrosine-based nor the dileucine-based putative sorting signals in the C-terminus of HRG-1 are crucial for its lysosomal localisation. Comparing the protein levels of HRG-1 in wild-type and LAMP-2 knockout organs a decrease in HRG-1 expression could be observed in LAMP-2 knockout tissues, which is apparently not due to a down regulation of HRG-1 specific transcription. The function of HRG-1 as a heme exporter was further investigated in splenic reticuloendothelial cells. In LAMP-2 knockout spleens an infiltration of CD68+ tissue macrophages was observed as well as an age dependent accumulation of ferric iron (Fe3+) in these cells. Both HRG-1 and heme oxygenase 1 (HO-1) levels were increased in tissue macrophages. A connection between defects in the autophagic degradation of intracellular iron stores (ferritin) and the accumulation of autophagic vesicles in patients with Danon disease was postulated. The accumulation of iron in LAMP-2 knockout spleens is accompanied by changes in erythropoiesis, which hints at a deficiency in iron recycling. An erythrophagocytosis assay showed an increase in HRG-1 and LAMP-1 in the erythro-phagolysosomal membrane of LAMP-2 knockout macrophages compared to wild-type. Taken together, this study shows HRG-1 as a new interaction partner of LAMP-2 and uncovers changes in the iron homoeostasis of LAMP-2-deficient mice.

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Allerding, Mirka: Charakterisierung des Heme-Responsive Gene 1-Proteins (HRG-1) als Interaktionspartner des Lysosomal-Assoziierten Membranproteins Typ 2 (LAMP-2).

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