Untersuchungen zur intestinalen Verträglichkeit von Hydroxyethylstärke : Etablierung und Validierung eines neuen isoliert perfundierten Mausdünndarm-Modells

Wong, Yuk Lung

Im klinischen Einsatz werden bei intravasalem Volumenmangel neben kristalloiden auch kolloidale Infusionslösungen wie die Hydroxyethylstärke (HES) zur Therapie eingesetzt. Das Ziel dieser Flüssigkeitssubstitution ist eine Wiederherstellung des intravasalen Volumens und die Vermeidung von kardiovaskulär bedingter Hypoxie in Organen und Geweben. Aktuell wird der klinische Einsatz von HES kontrovers diskutiert, da neue Studien ein ungünstiges Nutzen-Risiko-Verhältnis für HES aufzeigten. Bislang wurde die intestinale Wirkung einer HES-Perfusion sowie die assoziierten physiologischen und zellulären Mechanismen trotz der hohen klinischen Relevanz des Darms im Rahmen der Sepsis und Ödembildung kaum untersucht, was unter anderem auch auf das Fehlen geeigneter ex vivo Modelle zurückzuführen ist. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Analyse der physiologischen und zellulären Effekte einer vaskulären Perfusion mit HES auf die intestinale endotheliale und epitheliale Permeabilität unter Verwendung eines neu etablierten ex vivo Mausdünndarm-Modells. Hierzu wurden Dünndärme aus C57/BL6 Mäusen unter Sevofluran/Ketamin-Narkose isoliert und an ein für das Mausmodell modifiziertes Perfusionssystem angeschlossen. Für die erfolgreiche Etablierung mussten zahlreiche systemspezifische Anpassungen vorgenommen werden. Neben Veränderungen an den Kanülen, der Perfusionsparameter und der Waagen, wurde eine neue Vorrichtung für den Transfer des isolierten Mausdünndarms (in vivo) in die Perfusionskammer (ex vivo) entwickelt. Zur Validierung des Modells wurden die Mausdünndärme vaskulär mit 3 % Rinderserumalbumin (BSA) in modifiziertem Krebs-Henseleit-Puffer perfundiert (Kontrollgruppe) und in einer weiteren Gruppe mit einem Bolus Plättchen aktivierender Faktor (PAF) stimuliert. Für die Untersuchung der intestinalen Verträglichkeit von HES wurde das vaskuläre Perfusat nach 60 Minuten Equilibrierungsphase von 3 % BSA auf 3 % HES 130/0,4 bzw. HES 200/0,5 gewechselt. Folgende Parameter wurden untersucht: Perfusionsraten und Perfusionsdrücke, die Flüssigkeitshomöostase, die Barriereintegrität, die luminale Galaktoseaufnahme, die Histomorphologie, das Laktat zu Pyruvat Verhältnis, das Feucht- zu Trockengewicht, die Sauerstoffaufnahme, der pH-Wert der Perfusate, die Darmmotilität und die Gewichtsveränderung des Darms. Die Barriereintegrität wurde anhand der Übertrittsrate des vaskulär applizierten FITC-Dextrans in das interstitielle und das luminale Effluat bestimmt. Nach der Perfusion wurden elektronenmikroskopische Aufnahmen des Darms in der Kontrollgruppe und der HES 130/0,4-Gruppe angefertigt. Es wurde sowohl für die Kontrollgruppe als auch für die Gruppe mit PAF-Stimulus eine intakte Flüssigkeitshomöostase, Barrierefunktion und luminale Galaktoseaufnahme über die Versuchsdauer nachgewiesen. Bis auf histomorphologische Schäden am Darmepithel zeigten die untersuchten Parameter einen funktionell intakten, isoliert perfundierten Mausdünndarm. Eine Umstellung des vaskulären Perfusats von 3 % BSA auf 3 % HES 130/0,4 oder 3 % HES 200/0,5 führte zu signifikanten Veränderungen in der Funktion, Flüssigkeitshomöostase, Permeabilität und Morphologie des Mausdünndarms. Die vaskuläre Perfusion mit HES verursachte eine signifikante Zunahme bei der Flüssigkeitsverschiebung vom vaskulären zum luminalen Kompartiment, was eine Störung der endothelialen und epithelialen Barrierefunktion suggerierte. Dieser Befund wurde durch die Ergebnisse des FITC-Dextran-Transfers unterstützt. Das vaskulär applizierte FITC-Dextran konnte unter Kontrollbedingungen die endotheliale und epitheliale Barriere nicht überwinden und war luminal nur in geringen Mengen nachweisbar. Bei der vaskulären Perfusion mit HES stieg der FITC-Dextran-Transfer von vaskulär nach luminal aufgrund der zunehmenden Permeabilisierung der Barriere signifikant an. Zudem konnten in elektronenmikroskopischen Aufnahmen histomorphologische Veränderungen in Form von vermehrten intrazellulären Vakuolen und erweiterten interzellulären Spalten im Darmepithel nach einer HES-Perfusion nachgewiesen werden. Zusätzlich führte die Perfusion mit HES zu einer signifikanten Reduktion der luminalen Galaktoseaufnahme, was eine mögliche Störung der Resorptionsprozesse im Darm durch HES zeigte. In der vorliegenden Arbeit konnte das isoliert perfundierte Mausdünndarm-Modell erfolgreich etabliert und validiert werden. Eine Perfusion mit 3 % HES führte im verwendeten ex vivo Maus-Modell zu einer Störung der Flüssigkeitshomöostase und erhöhter Permeabilität des Endothels und Epithels mit signifikanten histomorphologischen Veränderungen des Epithels. Als vaskuläres Perfusat war das eingesetzte HES im isoliert perfundierten Mausdünndarm unverträglich. Dieser Befund unterstützt die Empfehlung der europäischen Arzneimittelagentur wonach eine HES-Therapie bei Sepsis und schwerkranken Patienten nicht eingesetzt werden soll.

For the clinical therapy of acute volume deficiency cristalloids and colloids like hydroxyethyl starch (HES) are often used for the substitution of fluids and restoration of intravascular volume to avoid cardiovascular caused hypoxia in organs and tissues. The usage of HES is currently controversially discussed due to recent studies which show a negative benefit-risk-ratio. Clinical situations with intestinal related problems like sepsis and edema formation are common and improved knowledge about the physiological and cellular mechanisms is needed. Up to now the intestinal effect of HES perfusion has not been well investigated owing to the absence of suitable ex vivo models. The goal of this work was to study the physiological and cellular effects of vascular HES perfusion on the intestinal endothelial and epithelial permeability. For this purpose an ex vivo small intestine mouse model was established. The small intestine was isolated from with sevoflurane and ketamine anesthetized C57/BL6 mice. Numerous changes like the modification of the cannulas, perfusion parameters and electronic balances were needed to establish a specific perfusion system. A newly developed transport device ensures the transfer of the small intestine in vivo into the perfusion chamber ex vivo. For validation purposes a modified Krebs-Henseleit solution with 3 % bovine serum albumin (BSA) was used (control group) with or without an additional bolus of platelet-activating factor (PAF). To investigate the intestinal tolerance to HES 3 % BSA was used in the equilibration phase and switched to 3 % HES 130/0.4 and 3 % HES 200/0.5, respectively. Perfusion rate, perfusion pressure, fluid homeostasis, barrier integrity, luminal galactose uptake, histomorphology, lactate to pyruvate ratio, wet to dry weight ratio, oxygen uptake, perfusate pH, bowel motility and bowel weight changes were observed. Barrier integrity was measured by vascularly applied FITC-dextran and its transfer rate into the interstitial and luminal compartment. Electron micrographs were taken in the control group and HES 130/0.4 group after perfusion. The fluid homeostasis, barrier integrity, and luminal galactose uptake during perfusion was intact in the control group as well as in the PAF group. Observed parameters confirmed a functional intestine despite apparent histomorphological damage in intestinal epithelia. In comparison a perfusion with HES 130/0.4 or HES 200/0.5 led to significant alteration in fluid distribution from vascular into the luminal compartment. This was accompanied by a significant increment of FITC-dextran transfer from the vascular to luminal side, demonstrating a barrier dysfunction and increased permeability after HES perfusion. In normal cases vascularly applied FITC-dextran cannot permeate the endothelial and epithelial barrier and only small amounts of FITC-dextran are luminally detectable. Electron micrographs showed histomorphological changes with extended intercellular spaces and increased intracellular vacuoles. Perfusion with HES reduced the luminal galactose uptake significantly and suggested dysfunction in resorption. The present work presents a successful establishment and validation of an isolated perfused mouse small intestine. Perfusion with HES showed dysfunction in fluid homeostasis and increased endothelial and epithelial permeability. Histomorphological alterations were observed and support the assumption of intestinal intolerance for vascular HES perfusion in mice. These results support the recommendation of the European medicine agency to avoid HES therapy in sepsis and critically ill patients.

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Wong, Yuk Lung: Untersuchungen zur intestinalen Verträglichkeit von Hydroxyethylstärke : Etablierung und Validierung eines neuen isoliert perfundierten Mausdünndarm-Modells.

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