Map based cloning and functional analysis of two bolting time loci BTC1 and BvBBX19 in sugar beet (Beta vulgaris L.)

Dally, Nadine

Sugar beet (Beta vulgaris subsp. vulgaris), a biennial long day (LD) plant belonging to the family Chenopodiaceae, stores sucrose in a thickened taproot and is the only crop cultivated for sugar production in Europe. Full bolting time control is of substantial agronomic importance to prevent stem elongation (bolting) and flowering which result in decreasing root yield. The regulation of flowering time is well studied in the model species Arabidopsis thaliana and the induction of flowering through the zinc finger transcriptional regulator CONSTANS (CO) and the FLOWERING LOCUS T (FT) gene appears to be conserved in various plant species. In B. vulgaris, a new mechanism of flowering time regulation has been observed. Two FT paralogs BvFT1 and BvFT2 have evolved antagonistic functions, in which BvFT1 is a floral repressor and BvFT2 acts as a floral inducer. Annuals that flower under long days (LD) within one season carry the dominant pseudo response regulator (PRR) gene BOLTING TIME CONTROL 1 (BTC1), which shows homology to the PRR7 gene in A. thaliana. BTC1 promotes bolting and flowering through repression of BvFT1 and activation of BvFT2. By contrast, in biennials carrying the recessive btc1 gene, BvFT1 is not repressed and plants require a period of prolonged cold temperature over winter (vernalization) followed by LD for bolting induction. Protein sequences of the dominant and recessive BTC1 genes differ by several amino acid substitutions. Besides BTC1, three additional bolting loci B2, B3 and B4 have been previously identified after EMS mutagenesis of an annual genotype. So far, the two loci B2 and B4 were mapped to chromosome 9 and 2, respectively. A B2 mutant displays a biennial phenotype and thus requires vernalization for bolting induction. The aims of my study were (1) to fine-map the bolting locus B2 and to identify putative candidate genes, and (2) to investigated the function of BTC1 in transgenic A. thaliana and B. vulgaris plants to clarify whether the polypeptides encoded by the dominant and recessive BTC1 gene have the same function in beet and whether BTC1 and PRR7 are orthologs. In order to fine-map the B2 locus, 5457 F2 plants from a cross of a biennial B2 mutant and an annual wild beet and 2549 F2:3 families were phenotyped for bolting behavior. Finally, 1301 F2 plants were genotyped with molecular markers. I used the draft assembly of the sugar beet reference sequence to develop molecular markers and identified two markers flanking the B2 locus in a genetic distance of 1.9 cM. I screened this region for candidate genes using a collection of predicted gene models of the sugar beet reference sequence. This enabled the identification of a candidate gene which shows an overall sequence identity of 55% on amino acid level to BBX19, a B-box zinc finger family protein of A. thaliana, comprising two B-box domains. Accordingly, I termed the newly detected candidate gene BvBBX19. A molecular marker located in the 3`-UTR of BvBBX19 completely co-segregates with the F2 phenotypes (1295 F2 plants). I identified a single transition in each of two independent mutants that occurred at different positions within the candidate gene. Both mutations are likely to be induced through the EMS treatment and alter the amino acid sequence of the BvBBX19 protein. These results give strong evidence that BvBBX19 is likely to be the sought gene encoding the B2 phenotype. The function of the different BTC1 alleles was first verified by constitutive expression of both BTC1 coding sequences in A. thaliana wildtype and late flowering prr7 mutant plants. I observed no significant differences for bolting and flowering in segregating T2 families. BTC1 neither accelerated flowering in the wildtype nor complemented the late flowering prr7 mutant. These results suggest that BTC1 is not an ortholog of PRR7 and has a different function in B. vulgaris compared to A. thaliana. Second, I investigated the BTC1 function in B. vulgaris plants (T1 generation). I observed no phenotypic differences in plants carrying the dominant BTC1 transgene compared to those carrying the recessive btc1 transgene, before as well as after cold treatment. However, after cold treatment I observed bolting and never bolting (non bolting after cold treatment) individuals. Expression analysis and copy number determination revealed an upregulation of BTC1 and a downregulation of BvFT1 in bolting plants that carry a single copy of the transgene. By contrast, BTC1 is completely downregulated and BvFT1 is highly upregulated in never bolting plants carrying multiple integrations of the transgene. These results demonstrate for the first time transgene-mediated co-suppression in transgenic sugar beet plants and thus confirm also that both BTC1 genes have the same function. Beyond the aims of my study, I further investigated the expression of BvBBX19 in bolting and never bolting transgenic beets as well as in the parental accessions of the F2 population, in comparison with BTC1, BvFT1 and BvFT2. The results of this analysis indicate that BvBBX19 acts in conjunction with BTC1 upstream of BvFT1 and BvFT2 to induce bolting and flowering in beet. Under the assumption that BvBBX19 and BTC1 proteins interact with each other, the resulting protein complex would have i.a. two B-box and a CCT domain and thus resemble the domain structure of CO. Accordingly I hypothesize that in beet a CO function is achieved through interaction of BvBBX19 and BTC1. The results of my work largely extended our knowledge about bolting and flowering time regulation in beet which is of substantial importance for breeding winter beets with controlled bolting behavior.

Die einzige Kulturpflanze, die in Europa zur Zuckerproduktion angebaut wird, ist die Zuckerrübe (Beta vulgaris subsp. vulgaris). Diese zweijährige Langtagpflanze speichert Zucker in ihrer Pfahlwurzel, wobei durch die Streckung der Sprossachse (Schossen) und anschließendes Blühen der Wurzelertrag und somit auch der Zuckerertrag reduziert werden. Für die Kultivierung von Zuckerrüben ist folglich die Blühzeitkontrolle, die bisher in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana am besten untersucht worden ist, von erheblicher agronomischer Bedeutung. In A. thaliana wird die Blühinduktion durch die Expression des Zinkfinger-Transkriptionsfaktors CONSTANS (CO) sowie durch das von FLOWERING LOCUS T (FT) kodierte Protein reguliert, ein Mechanismus, der in vielen anderen Spezies konserviert zu sein scheint. In B. vulgaris wurde ein gegenläufiger Prozess der Blühzeitpunkt-Regulation durch zwei FT Paraloge BvFT1 und BvFT2 nachgewiesen, bei dem BvFT1 als Blührepressor fungiert, während BvFT2 die Blühphase induziert. Einjährige B. vulgaris Pflanzen, die unter Langtag Bedingungen im ersten Jahr blühen, tragen das dominante Allel des Pseudo Response Regulator (PRR) Gens BOLTING TIME CONTROL 1 (BTC1). Dieses ist homolog zu PRR7 in A. thaliana und induziert Schossen und Blühen durch Repression von BvFT1 und Aktivierung von BvFT2. Zweijährige Pflanzen hingegen, die das rezessive btc1 Gen tragen, zeigen keine Repression des BvFT1 Gens und schossen und blühen somit erst nach einer längeren winterlichen Kälteperiode (Vernalisation), gefolgt von Langtag-Bedingungen. Die Sequenz des vom dominanten BTC1 Gen abgeleiteten Proteins unterscheidet sich von der des rezessiven in einigen Aminosäuren. Durch chemische Mutagenese eines einjährigen Genotyps wurden bisher drei weitere Genloci (B2, B3 und B4) identifiziert, von denen zwei auf Chromosom 9 (B2) bzw. Chromosom 2 (B4) lokalisiert sind. Es standen B2 Mutanten zu Verfügung, die einen zweijährigen Phänotyp aufzeigten und entsprechend erst nach Vernalisation schossten. Ziel meiner Arbeit war es (1) eine Feinkartierung des zweiten Schosslokus (B2) durchzuführen und potentielle Kandidatengene in dieser Region zu identifizieren, sowie (2) die Funktion des BTC1 Gens zu bestimmen mit der Fragestellung, ob die von dem dominanten und rezessiven BTC1 Gen kodierten Polypeptide sich funktionell unterscheiden und ob BTC1 und PRR7 funktionell orthologe Gene sind. Für die Feinkartierung des Lokus B2 wurde eine 5457 Pflanzen umfassende F2 Population aus der Kreuzung einer zweijährigen B2 Mutante mit einer einjährigen Wildrübe genutzt. Daraus wurden durch Selbstung 2549 F2:3 Familien erzeugt. Die F2 Population und F2:3 Familien wurden hinsichtlich ihres Schosserverhaltens phänotypisiert. Insgesamt wurden 1301 F2 Pflanzen mit molekularen Markern genotypisiert. Für die Entwicklung molekularer Marker verwendete ich eine vorläufige Version der Zuckerrüben Referenzsequenz. Auf diese Weise konnten zwei Marker, die den Lokus B2 in einem genetischen Abstand von 1.9 cM flankieren, identifiziert werden. Zur Identifikation potentieller Kandidatengene innerhalb dieser Region verwendete ich eine Kollektion vorhergesagter Genmodelle innerhalb der Referenzsequenz. Dadurch konnte ein Kandidatengen mit zwei B-Box Domänen, dessen Proteinsequenz zu 55% homolog zu dem A. thaliana BBX19 Protein aus der Familie der B-Box Zinkfinger Transkriptionsfaktoren ist, identifiziert werden. Dieses in B. vulgaris gefundene Gen bezeichnete ich als BvBBX19. Ein Marker, der aus der BvBBX19 3`-UTR abgeleitet worden war, war vollständig mit dem B2 Lokus gekoppelt (1295 F2 Pflanzen). In zwei unabhängigen Mutanten konnte ich die Anwesenheit von zwei unterschiedlich lokalisierten einzelnen Transitionen in BvBBX19 nachweisen, die auf chemische Mutagenese hinweisen und jeweils zu einer Veränderung der Proteinsequenz führen. Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass es sich bei BvBBX19 um das Gen handelt, welches für den B2 Phänotyp kodiert. Um die Funktion des dominanten und rezessiven BTC1 Gens zu analysieren, wurden zunächst die kodierenden Sequenzen der BTC1 Gene im A. thaliana Wildtyp und in spät blühenden prr7 Mutanten konstitutiv exprimiert. BTC1 förderte in spaltenden T2 Familien weder das Blühen im Wildtyp- Hintergrund noch komplementierte es die spät blühende prr7 Mutante. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass BTC1 kein funktionelles Ortholog von PRR7 ist und somit in B. vulgaris eine andere Funktion hat als in A. thaliana. Auch in einer zweijährigen B. vulgaris Linie wurden die kodierenden Sequenzen der BTC1 Gene konstitutiv exprimiert. B. vulgaris Pflanzen (T1 Generation), die das dominante BTC1 Transgen trugen, zeigten hinsichtlich ihrer Schossneigung, sowohl vor als auch nach Vernalisation, keinen signifikanten Unterschied zu solchen, die das rezessive Transgen trugen. Allerdings beobachtete ich nach der Kältebehandlung schossende und nicht schossende („nie schossende“) Pflanzen. Mit Hilfe von Expressionsanalysen und Bestimmung der Genkopien-Anzahl konnte ich zeigen, dass schossende Pflanzen nur eine Kopie des Transgens trugen, was mit einer Hochregulation von BTC1 bei gleichzeitiger Herabregulation von BvFT1 einherging. Im Gegensatz dazu zeigten nie schossende Pflanzen, die mehrere Kopien des Transgens trugen, eine vollständige Herabregulation von BTC1 und eine Hochregulation von BvFT1. Diese Ergebnisse zeigen erstmals eine durch das BTC1 Transgen vermittelte Co Suppression in transgenen Zuckerrüben und belegen die Funktions-Gleichheit der beiden BTC1 Proteine aus ein- und zweijährigen Pflanzen. Weiterhin untersuchte ich die Expression von dem identifizierten BvBBX19 Gen in schossenden und nie schossenden transgenen Pflanzen sowie in den Eltern der F2 Population und verglich sie mit der Expression der BTC1-, BvFT1- und BvFT2- Gene. Die Ergebnisse dieser Analyse deuten darauf hin, dass es sich bei BvBBX19 um ein Gen handelt, das gemeinsam mit dem dominanten BTC1 Allel die Regulation der Gene BvFT1 und BvFT2 übernimmt um Schossen in Zuckerrüben zu induzieren. Unter Berücksichtigung einer potentiellen Protein-Protein Interaktion von BvBX19 und BTC1 würde dieser Proteinkomplex unter anderem zwei B-Box und eine CCT-Domäne enthalten und somit der Domänen Struktur des CO-Proteins ähneln. Somit könnte die Funktion von CO in Zuckerrüben durch eine Interaktion der Proteine BvBBX19 und BTC1 übernommen werden. Durch die Ergebnisse meiner Arbeit konnten grundlegende neue Erkenntnisse zur Regulation des Schoss- und Blühzeitpunktes in der Zuckerrübe gewonnen werden, die für die Züchtung von Winter-Zuckerrüben mit kontrolliertem Schossverhalten von wesentlicher Bedeutung sind.

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Dally, Nadine: Map based cloning and functional analysis of two bolting time loci BTC1 and BvBBX19 in sugar beet (Beta vulgaris L.). 2013.

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