Entwicklung eines Transposon-Mutagenese-Systems für biotechnologisch relevante Hyphenpilze

Hihlal, El Kbir

Das Transposon Vader gehört zur Fot1/pogo-Transposonenfamilie, das in den Hyphenpilzen Aspergillus niger var. Awamori und Aspergillus niger CBS513.88 nachgewiesen wurde. A. niger CBS513.88 ist ein imperfekter Ascomycet, der biotechnologische Bedeutung erlangt hat. Ziel der hier vorliegenden Arbeit war es, das Vader-Mutagenese-System in homologen sowie in heterologen Wirten zu untersuchen. Um die Transposition des Vader-Elements zu überprüfen, wurden phänotypische sowie molekulare Analysen von Transpositionsereignissen durchgeführt. A) Für die Analysen zur Überprüfung des „Transposon-Tagging“-Systems mit dem Vader-Element wurde das Konstrukt pIB635 mit einer klonierten, synthetischen Vader-Kopie in A. niger CBS513.88 eingebracht. Die daraus resultierende Transformante wurde AnT6(3) bezeichnet (Braumann, 2008). Das verwendete Konstrukt enthält das Vader-Element zwischen dem Promotor pgdA und dem hph-Gen. Mittels einer Selektion auf Hygromycin-B wurden putative Exzisionsereignisse in AnT(6)3 identifiziert. Die Exzisionsfrequenz lag bei 1 zu 2,2*105. B) Zur molekularen Charakterisierung wurde eine PCR-Analyse mit den Oligonukleotiden IB1343 und IB1344 durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden entweder mit IB1343 oder IB1344 sequenziert. In fast allen Fällen fehlte die Vader-Sequenz vollständig. Da nur die flankierenden Sequenzen des Vader-Elements (Promotor pgdA und hph-Gen) vorhanden sind, handelte es sich um eine Exzision des synthetischen Vader-Transposons. C) Putative Exzisionsstellen wurden nach der PCR-Analyse sequenziert. Dabei wurden acht unterschiedliche „footprints“ im Bereich der Exzisionsstelle zwischen dem Promotor pgdA und dem hph-Gen identifiziert. Bei einer putativen Exzisionsstelle, die durch Sequenzierung überprüft wurde, wurde eine präzise Exzision des synthetischen Vader-Elements gefunden. Bei der Analyse der Vader-„footprints“ handelte es sich um zwei typische und sechs atypische „footprints“ sowie eine präzise Exzision. D) Bei der Analyse auf Reintegrationen des exzisierten, synthetischen Vader-Elements mittels einer PCR-Analyse mit den Oligonukleotiden IB1345 und IB925 wurden von 97 Hygromycin-resistenten Kolonien nach der Exzision 95 putative Reintegrationen des Vader-Transposons nachgewiesen. Die PCR-Analyse zeigte, dass in fast allen Fällen eine Reintegration des Vader-Elements in das Genom erfolgt war. E) Um nähere Hinweise auf die Insertionsstellen des Vader-Transposons zu erhalten, wurde die TAIL-PCR-Analyse durchgeführt. 27 Integrationsstellen wurden molekular charakterisiert und zeigten eine Verteilung der Reintegration auf acht Chromosomen. Fast alle Reintegrationsereignisse erfolgten in Genen oder ihrer unmittelbaren Nachbarschaft. Von den 27 charakterisierten Ereignissen waren zwei durch einen veränderten Phänotypen gekennzeichnet. Damit wurde erstmals ein effizientes und funktionierendes Transposon-Mutagenese-System für A. niger etabliert. Von 27 Reintegrationsstellen wurden 13 in Intronen identifiziert. Bei dieser Reintegration wurde eine OneStep-RT-PCR-Analyse durchgeführt. Bei der Insertion in Intronen wurde das Transposon herausgespleißt, wodurch das betroffene Gen nicht ausgeschaltet wurde. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde nachgewiesen werden, dass das Transposon Vader effizient exzisiert und sich ektopisch ins Genom von A. niger reintegriert. Daraus kann man schließen, dass Vader ein geeignetes Werkzeug für die Transposon-Mutagenese in A. niger ist. F) Der zweite Teil dieser Arbeit befasste sich mit der Erstellung eines Transposon-Mutagenese Systems für Aspergillus nidulans. Im Rahmen dieser Arbeit konnten die Vektoren pE751 und pEH772 erstellt werden. Der Vektor pEH751 verfügt nur über das synthetische Vader-Transposon. Der Vektor pEH772 ist ein Zwei-Komponenten-System und besitzt das synthetische Vader-Element und das Tan1-Gen mit seinem eigenen Promotor. Mittels flankierender Sequenzen aus dem niaD-Gen wurden die Vektoren per homologer Rekombination im niaD-Locus von A. nidulans integriert. Bei einer Analyse auf homologe Rekombination mittels einer PCR-Analyse und Southern-Hybridisierung mit einer Tan1- und hph-spezifischen Sonde wurden Transformanten nachgewiesen. Aufgrund des hph-Gens als Selektionsmarker konnten keine putativen Exzisionen identifiziert werden

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Hihlal, El Kbir: Entwicklung eines Transposon-Mutagenese-Systems für biotechnologisch relevante Hyphenpilze.

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