Sensitivierung von humanen Glioma-Zellen für die zytostatische/zytoletale Wirkung von Arsentrioxid durch Kombination mit pflanzlichen Polyphenolen und Buthioninsulfoximin

Klauser, Ellen

Arsentrioxid (ATO) induziert klinische Remission bei der akuten Promyelozytenleukämie und Proliferationshemmung bei zahlreichen Zelllinien in vitro. Vorausgehende Studien haben berichtet, dass pflanzliche Polyphenole die zytotoxische Wirkung von ATO und die Induktion von Apoptose bei Tumorzellen verschiedener Abstammung verstärken, indem sie zu einer erhöhten Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) oder einer Verminderung der intrazellulären Glutathionspiegel führen. Im Hinblick auf alternative Therapieansätze für Patienten mit malignen Gliomen wurde in der vorliegenden Arbeit die proliferationshemmende Potenz von ATO bei zwei humanen Glioma-Zelllinien (A-172 und U-87 MG) untersucht. Weiterhin wurde geprüft, ob die verwendeten Zelllinien für die Wirkung von ATO durch den gleichzeitigen Einsatz von verschiedenen Polyphenolen (Genistein, Quercetin, Curcumin, Resveratrol, Epigallocatechin-3-gallat (EGCG)) bzw. Buthioninsulfoximin (BSO), einen Inhibitor der Glutathionsynthese, sensitiviert werden können. ATO (0,5 - 20 μM) hemmt die Proliferation von A-172 und U-87 MG Zellen konzentrations- und zeitabhängig. Bis zu einer Konzentration von 5 μM ist die Proliferationshemmung jeweils auf zytostatische und bei höheren Konzentrationen (≥ 10 μM) auf zytoletale Effekte zurückzuführen. Letztere sind nach 72 h mit einer Induktion von Apoptose verbunden. Das Ausmaß des apoptotischen Zelltods wurde über Veränderungen der Zellkernmorphologie, die Externalisierung von Phosphatidylserin und den DNA-Gehalt im Zellzyklus quantifiziert. Bei U-87 MG Zellen ist die Hemmung des Wachstums außerdem mit einem Zellzyklusarrest in der G2/M-Phase verknüpft. Nekrotischer Zelltod spielt bei beiden Zelllinien keine wesentliche Rolle. Die Wirkung von ATO wird nicht durch erhöhte ROS-Bildung (bestimmt mit DCFH2-DA als Biomarker) oder Verminderung der intrazellulären Glutathionspiegel vermittelt. Im Gegenteil, ATO induziert eindeutig Erhöhungen des Glutathiongehalts. Der maximale Effekt (~ 40%) wird bei subtoxischen Konzentrationen (0,5 - 2 μM) erreicht. Von den untersuchten Polyphenolen löst Genistein in beiden Zelllinien und Resveratrol in U-87 MG Zellen eine verstärkte Bildung von ROS aus. Quercetin, Curcumin und EGCG wirken dagegen antioxidativ und vermindern die endogene ROS-Bildungsrate. Curcumin und Resveratrol besitzen außerdem einen Einfluss auf die intrazellulären Glutathionspiegel. Sie induzieren in beiden Zelllinien einen Anstieg der Levels. BSO führt dagegen zu einer drastischen Verarmung an Glutathion. Die Kombinationswirkung von ATO und den Polyphenolen auf das Wachstum der Glioma-Zellen wurde mit Hilfe der Isobologramm- und der Kombinationsindex-Methode ermittelt. Dazu wurden die Konzentrations-Wirkungs-Kurven für Wachstumshemmung der Einzelsubstanzen und ihrer Kombinationen herangezogen. Die gemeinsame Wirkung der Agentien ist teilweise vom betrachteten Effektniveau abhängig und zelllinienspezifisch. Genistein und Quercetin erhöhen die Empfindlichkeit von A-172 Zellen für die proliferationshemmende Wirkung von ATO sowie die Induktion von Apoptose. Entsprechende Kombinationen wirken bei U-87 MG Zellen allerdings nur additiv bzw. sogar antagonistisch auf das Wachstum und erhöhen die Induktion von Apoptose nicht. Curcumin, Resveratrol und EGCG sensitivieren beide Zelllinien nicht für ATO. Hier zeigen sich jeweils additive und/oder antagonistische Effekte. Eine deutliche Sensitivierung für ATO (Proliferationshemmung und Apoptoseinduktion) findet bei A-172 und U-87 MG Zellen in Anwesenheit von BSO statt, das selbst nicht zytotoxisch ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit machen deutlich, dass die ausgewählten Polyphenole - im Unterschied zu BSO - kaum geeignete Sensitizer sind, um die proliferationshemmende Wirkung von ATO auf A-172 und U-87 MG zu verstärken. Die Verminderung der intrazellulären Glutathionspiegel, nicht aber eine gesteigerte Bildung von ROS erweist sich als Strategie zur Erhöhung der zytotoxischen ATO-Wirkung auf die verwendeten Glioma-Zellen. Kombinationen von ATO und BSO könnten einen geeigneten Ansatz zur Therapie maligner Glioma darstellen.

Arsenic trioxide (ATO) induces clinical remission in acute promyelocytic leukemia and growth inhibition in various cancer cell lines in vitro. Recent studies have reported that plant polyphenols potentiate ATO-provoked cytotoxicity and apoptosis induction in cancer cells from different origin via enhanced reactive oxygen species (ROS) generation or cellular glutathione depletion. Searching for alternative therapy approaches for patients with malignant gliomas in this study the potency of ATO to inhibit proliferation in two human glioma cell lines (A-172 and U-87 MG) was investigated. Furthermore, it was examined, whether selected polyphenols (genistein, quercetin, curcumin, resveratrol, epigallocatechin-3-gallate (EGCG)) and buthionine-sulfoximine (BSO), an inhibitor of glutathione biosynthesis, are able to sensitize the cell lines for the action of ATO. ATO (0.5 - 20 μM) inhibited the proliferation of A-172 and U-87 MG cells in a concentration- and time-dependent manner. Up to 5 μM ATO acted as cytostatic and at higher concentrations (≥ 10 μM) it caused lethal effects. The latter were associated with apoptosis induction after 72 h. The extent of apoptotic cell death was measured via nuclear morphological changes, externalization of phosphatidylserine and DNA-content in the cell cycle. In addition in U-87 MG cells growth inhibition was also associated with a cell cycle arrest in the G2/M-phase. Necrotic cell death only played a minor role in both cell lines. The action of ATO was accompanied neither by enhanced ROS generation (using DCFH2-DA as indicator) nor decreased glutathione levels. In contrast, ATO significantly enhanced glutathione levels. The maximum effect (~ 40%) occurred at sub-toxic concentrations (0.5 - 2 μM). Of all studied polyphenols genistein enhanced ROS generation in both cell lines, while resveratrol did it only in U-87 MG cells. Quercetin, curcumin und EGCG acted as antioxidants and decreased the endogenous ROS generation rate. Curcumin and resveratrol also influenced the cellular glutathione contents. They induced an increase of the levels in both cell lines. In contrast, BSO led to drastic glutathione depletion. The combination effects of ATO and the polyphenols on the growth of the glioma cells was investigated via isobolographic- and combination index-analysis. For this purpose concentration-response curves for growth inhibition caused by the agents alone and in combination were used. The combination effects of the agents depended in part on the effect levels regarded and were cell type-specific. Genistein and quercetin enhanced the sensitivity of A-172 cell for growth inhibition and apoptosis induction provoked by ATO. Corresponding combinations acted in U-87 MG cells only additive and even antagonistic, respectively, on the growth and did not enhance the induction of apoptosis. Curcumin, resveratrol und EGCG did not sensitize both cell lines for ATO. Instead, the effects were additive and/or even antagonistic. A strong sensitization for ATO (growth inhibition and apoptosis induction) occurred in the presence of BSO at non-cytotoxic concentrations. The results presented in this study indicate that the used polyphenols - in contrast to BSO - are not suitable “sensitizers” to potentiate ATO-induced growth inhibition in A-172 and U-87 MG cells. Thus, depletion of cellular glutathione contents rather than an increase in ROS generation represents a useful strategy to enhance ATO-provoked cytotoxicity in glioma cells. Combinations of ATO and BSO could be an alternative therapy approach for malignant gliomas.

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Klauser, Ellen: Sensitivierung von humanen Glioma-Zellen für die zytostatische/zytoletale Wirkung von Arsentrioxid durch Kombination mit pflanzlichen Polyphenolen und Buthioninsulfoximin. 2014.

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