Stable spray dried protein formulation and implementation in vaccine development

Ajmera, Ankur

Proteins and peptides have escalated as an important class of therapeutic drugs for treating several chronic and acute illnesses. However, these macromolecules mostly have to be stored and transported under refrigeration as they are unstable at ambient temperatures. Limited storage stability also impedes their commercialisation. To increase their stability, biologicals are often formulated in dried state which generally requires stabilising excipients to protect proteins during drying. This thesis reports a successful development of biologically active and stable protein formulation using suitable excipients during spray drying. In this work, the ability of amino acids (ranging from large hydrophobic to small hydrophilic) and their combinations to stabilise proteins during spray drying was evaluated. On spray drying with the combination of arginine and glycine it could be shown that model proteins catalase and lysozyme maintain their activity on drying and remain stable after storage. It was shown that an influenza A (H1N1) vaccine (Pandemrix) in spray dried form is more stable compared to classical liquid vaccine which completely loses its activity especially when stored for 1 month at stress conditions whereas the dried formulation is found to be stable for more than 3 months under such harsh conditions. Surface activity of these amino acids protects the proteins from interfacial stress during spray droplet formation combined with water replacement mechanisms and creation of an amorphous matrix to ensure stability in the dried state. This combination is tailored to the needs of protein stabilisation during spray drying and may hence be utilised in dry powder formulation of biomolecules with superior stability characteristics. Stabilising and Protecting Solution (SPS; Leukocare, Germany) formulation technology which makes use of the stabilisation effect of amino acids was also evaluated as a potential spray drying protecting excipient. The effectiveness of SPS as a stabilising excipient for proteins during spray drying was established first using the model protein (ovalbumin) and then the results were transferred to influenza A (H1N1) vaccine. Several characterisation methods such as gel-electrophoresis, size exclusion chromatography, dynamic light scattering and a functional assay were used to optimise the dried formulation and to evaluate the long term storage stability. It could be shown by haemagglutination assay that the Pandemrix vaccine spray dried with SPS is stable and as functional as the original liquid vaccine. Terminal sterilisation was also possible for this formulation without harming the vaccine. Storage data showed high stability of protected vaccines at 2-8°C and 25°C/60% rH, for at least six months. The preclinical in vivo study (done in cooperation with Public Health England, Proton Down, UK) showed that effectiveness of the dried influenza vaccine is comparable to that of the original liquid vaccine. Animals receiving original Pandemrix exhibited expected levels of seroconversion after 21 days (prime) and 48 days (boost) as assessed by haemagglutination inhibition assay. Boost immunisation with SPS-protected vaccine resulted in a strong increase in seroconversion but had only minor effects in animals treated with non SPS-protected vaccine. The results indicate the potential utility of spray-dried and terminally sterilised vaccines stabilised by mixtures of amino acids which likely solve the problems associated with the long term instability and cold chain requirement of liquid vaccines.

Proteine und Peptide sind zu einer wichtigen Arzneistoffklasse für die Behandlung zahlreicher akuter und chronischer Krankheiten aufgestiegen. Allerdings müssen die verwendeten Makromoleküle zumeist gekühlt gelagert und transportiert werden, da sie bei Raumtemperatur Instabilitäten zeigen. Die begrenzte Lagerstabilität ist zudem eine Behinderung für die Vermarktung. Um die Stabilität zu erhöhen, werden Biopharmazeutika häufig in getrocknetem Zustand formuliert, was in der Regel jedoch den Einsatz von stabilisierenden Hilfsstoffen zum Schutz der Proteine während der Trocknung nötig macht. Diese Dissertation berichtet über eine erfolgreiche Entwicklung von einer biologisch aktiven und stabilen Proteinformulierung mittels geeigneter Trägerstoffe bei der Sprühtrocknung. In dieser Arbeit wurden einzelne Aminosäuren (von großen hydrophoben bis zu kleinen hydrophilen) sowie Kombinationen daraus hinsichtlich ihrer Fähigkeit untersucht, Proteine während des Sprühtrockungsprozesses zu stabilisieren. So konnte nach der Sprühtrocknung mit einer Kombination von Arginin und Glycin gezeigt werden, dass die Aktivität der Modellproteine Catalase und Lysozym beim Trocknen erhalten und die Formulierung auch nach weiterer Lagerung stabil blieb. Es wurde weiterhin gezeigt, dass ein Influenza A (H1N1)-Impfstoff (Pandemrix) in sprühgetrockneter Form im Vergleich zur klassischen flüssigen Formulierung eine verbesserte Stabilität aufweist. Der flüssige Impfstoff verliert seine Aktivität vollständig, wenn er für einen Monat bei Stressbedingungen gelagert wird, während die sprühgetrocknete Formulierung über einen Zeitraum von mehr als drei Monaten unter solch schwierigen Bedingungen stabil bleibt. Die Oberflächenaktivität der verwendeten Aminosäuren schützt die Proteine vor Grenzflächenspannungen während der Tröpfchenbildung. Hinzu kommen Wasser-Ersatzmechanismen und die Bildung einer amorphen Matrix, die eine erhöhte Stabilität im getrockneten Zustand gewährleisten. Diese Kombination von Aminosäuren ist auf die Bedürfnisse der Proteinstabilisierung während der Sprühtrocknung abgestimmt und kann daher in Trockenpulverformulierung von Biomolekülen mit überlegenen Stabilitätseigenschaften verwendet werden. Zusätzlich wurde eine Formulierungstechnologie basierend auf Stabilising and Protecting Solution (SPS; Leukocare, Deutschland), die ebenfalls den stabilisierenden Effekt von Aminosäurekombinationen ausnutzt, als potenzieller (Schutz-) Hilfsstoff für die Sprühtrocknung untersucht. Die Effektivität der SPS als stabilisierender Hilfsstoff für Proteine während der Sprühtrocknung wurde zunächst mit dem Modellprotein Ovalbumin überprüft, um anschließend die Ergebnisse auf den Influenza A (H1N1)-Impfstoff zu übertragen. Dabei wurden mehrere Charakterisierungsmethoden wie Gel-Elektrophorese, Größenausschlusschromatographie, dynamische Lichtstreuung und ein funktionaler Assay verwendet, um die getrocknete Formulierung zu optimieren und deren Langzeitlagerstabilität zu beurteilen. Es konnte durch Hämagglutinations-Assay gezeigt werden, dass der mit SPS sprühgetrocknete Impfstoff stabil ist und die gleiche Aktivität wie der flüssige Originalimpfstoff aufweist. Zudem war eine Endsterilisation dieser Formulierung möglich, ohne den Impfstoff zu schädigen. Untersuchungen zur Lagerstabilität zeigten eine hohe Stabilität der geschützten Impfstoffe bei 2-8°C und 25°C/60% relativer Feuchte für mindestens sechs Monate. Eine vorklinische in vivo Studie (durchgeführt in Zusammenarbeit mit der Public Health England, Proton Down, UK) zeigte weiterhin, dass die Wirksamkeit des getrockneten Influenza-Impfstoffs vergleichbar mit der des ursprünglichen, flüssigen Impfstoffs ist. Tiere, die die Originalformulierung Pandemrix erhielten, wiesen das zu erwartete Serokonversionsniveau nach 21 Tagen („Prime“) und 48 Tagen („Boost“) auf, welches durch Hämagglutinationsinhibitions-Assays bestimmt wurde. Eine Boost-Immunisierung mit SPS-geschütztem Impfstoff führte zu einem starken Anstieg der Serokonversion, wohingegen die boost-Immunisierung mit nicht SPS-geschütztem Impfstoff nur geringe Effekte erzielte. Die Ergebnisse verdeutlichen den potentiellen Nutzen von sprühgetrockneten und abschließend sterilisierten Impfstoffen, die mithilfe einer Kombination von Aminosäuren stabilisiert werden. Sie besitzen das Potential, Einschränkungen bei der Verwendung flüssiger Impfstoffformulierungen wie Langzeitinstabilitäten und Einhaltung der Kühlkette zu umgehen.

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Ajmera, Ankur: Stable spray dried protein formulation and implementation in vaccine development. 2014.

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