Pentosestoffwechsel in halophilen Archaea Abbauwege, Enzyme und transkriptionelle Regulation

Sutter, Jan-Moritz

Der Pentosestoffwechsel und dessen Regulation sind in Archaea nur wenig untersucht. Bisherige Untersuchungen in dem Haloarchaeon Haloferax volcanii zum D-Xylose- und L Arabinoseabbau haben ergeben, dass die Pentosen oxidativ zu α-Ketoglutarat umgewandelt werden. Die erste Reaktion dieses Abbauweges wird durch zwei distinkte Dehydrogenasen, die D-Xylose-Dehydrogenase und die L-Arabinose-Dehydrogenase, katalysiert. An der weiteren Umsetzung von D-Xylonat und L-Arabinoat zu α-Ketoglutarat sind die gleichen Gene beteiligt, die für die D-Xylonat-Dehydratase, die 2-Keto-3-Desoxy-D Xylonat-Dehydratase und die α-Ketoglutarat-Semialdehyd-Dehydrogenase kodieren. Alle Gene des D Xylose- und L-Arabinoseabbaus bilden ein Gencluster, das zusätzlich die Gene einer hypothetischen Lactonase (HVO_B0030) und des hypothetischen Transkriptionsregulators XacR (HVO_B0040) enthält. Ob die Lactonase und der Regulator XacR am Abbau von D Xylose und L-Arabinose beziehungsweise dessen transkriptioneller Regulation beteiligt sind, ist nicht bekannt. Bisherige Untersuchungen haben gezeigt, dass Haloarcula marismortui auf den Pentosen D Xylose und D-Ribose wächst, wobei der erste Schritt des Pentoseabbaus von einer bifunktionellen D Xylose-/ D-Ribose-Dehydrogenase katalysiert wird, was auf einen oxidativen Abbau hindeutet. Die weiteren Schritte des oxidativen Pentoseabbaus wurden bisher nicht untersucht. Vergleichende Genomanalysen mit Halorhabdus utahensis, der ebenfalls D Xylose als Wachstumssubstrat verwerten kann, haben ergeben, dass die Gene des oxidativen Pentoseabbaus in H. utahensis fehlen, dagegen konnten die Gene einer D-Xylose-Isomerase (Huta_2443) und einer D-Xylulose-Kinase (Huta_2446) identifiziert werden. Dies deutet darauf hin, dass dieses Haloarchaeon, wie die meisten Bacteria, D-Xylose zu D Xylulose-5-Phosphat abbaut. In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zum Pentoseabbau in drei Haloarchaeen durchgeführt. In H. volcanii wurde die Beteiligung einer Lactonase am Abbau von D-Xylose und L-Arabinose sowie die transkriptionelle Regulation der Gene des D-Xylose- und L Arabinoseabbaus durch den Transkriptionsregulator XacR untersucht. Aus H. marismortui Zellen wurden die Schlüsselenzyme des oxidativen Pentoseabbaus gereinigt und die kodierenden Gene identifiziert. Nach der Überexpression wurden die rekombinanten Enzyme gereinigt und charakterisiert. In H. utahensis Zellextrakten wurden die Aktivitäten der D Xylose-Isomerase und der D Xylulose-Kinase gezeigt, ferner wurde die rekombinante D Xylose-Isomerase nach Überexpression gereinigt und charakterisiert. D-Xylose- und L-Arabinoseabbau in Haloferax volcanii Nachweis und Charakterisierung einer Lactonase. Das Gen HVO_B0030 kodiert für eine putative Lactonase. Northern Blot-Analysen zeigten eine transkriptionelle Induktion dieser Lactonase beim Wachstum auf D-Xylose und L-Arabinose im Vergleich zu D-Glucose. Mit HPLC-Analysen wurde gezeigt, dass die D-Xylose-Dehydrogenase die Umsetzung von D Xylose zu D-Xylonolacton und die L-Arabinose-Dehydrogenase die Umsetzung von L Arabinose zu L-Arabinolacton katalysieren. Die gereinigte rekombinante Lactonase katalysierte die Umsetzung der beiden Lactone zu den entsprechenden Säuren, D-Xylonat beziehungsweise L-Arabinoat. Eine chromosomale Deletionsmutante der Lactonase zeigte im Vergleich zum Wildtyp ein eingeschränktes Wachstum auf L-Arabinose. Durch eine in trans Komplementation mit HVO_B0030 konnte der Wachstumsphänotyp des Wildtyps wiederhergestellt werden. Die Daten deuten darauf hin, dass HVO_B0030 für eine Lactonase kodiert, die funktionell am Abbau von D-Xylose und L-Arabinose beteiligt ist. Dies ist die erste Beschreibung einer Lactonase des Pentoseabbaus in der Domäne der Archaea. Transkriptionelle Regulation der Gene des D-Xylose- und L-Arabinoseabbaus. Die Transkriptanalysen aller Gene des D-Xylose- und L-Arabinoseabbaus zeigten eine transkriptionelle Induktion, sowohl beim Wachstum auf D-Xylose als auch auf L-Arabinose. Dies deutet auf einen gemeinsamen pentosespezifischen Transkriptionsregulator hin. Neben dem Gencluster der Gene des Pentoseabbaus wurde der hypothetische Transkriptions-regulator XacR, kodiert von HVO_B0040, identifiziert. Um zu prüfen, ob XacR an der Regulation des Pentoseabbaus beteiligt ist, wurden die Transkripte der Gene des Pentoseabbaus im Wildtyp mit einer Deletionsmutante von XacR verglichen. Es zeigte sich, dass die Transkripte dieser Gene nach der Induktion durch die Pentosen nur im Wildtyp, jedoch nicht in der Deletionsmutante von XacR nachgewiesen werden konnten. Dies deutet darauf hin, dass XacR als Transkriptionsaktivator der Gene des D-Xylose- und L Arabinoseabbaus fungiert. Eine mögliche Aktivatorbindestelle wurde durch Promotoranalysen identifiziert. Dazu wurden die ß-Galaktosidase Aktivitäten von bgaH-Reportergenfusionen des D Xylonat-Dehydratase Promotors bestimmt. Durch Deletions-mutagenese dieses Promotors wurde ein für die Aktivierung essentieller Bereich von 11 bp stromaufwärts der TATA-Box identifiziert, denn die Deletion dieses Bereiches führte zu einem Verlust der ß Galaktosidase Aktivität. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass XacR einen Repressor seiner eigenen Synthese darstellt, da die Deletion des XacR Gens zu einer erhöhten Promotoraktivität des XacR Promotors führte. In dem Promotor von XacR wurde eine AT reiche palindromische Sequenz identifiziert, deren Mutagenese ebenfalls zu einer erhöhten XacR Promotoraktivität führte. Das Motiv stellt eine mögliche Bindestelle für XacR als Repressor dar. Dies ist die erste Beschreibung eines Transkriptionsregulators des Pentoseabbaus in der Domäne der Archaea. D-Xylose- und D-Riboseabbau in Haloarcula marismortui Extrakte aus D-Xylose und D-Ribose gewachsenen H. marismortui Zellen katalysierten die Umsetzung von D-Xylonat beziehungsweise D-Ribonat zu α-Ketoglutarat. In diesen Extrakten konnten die Aktivitäten einer D-Ribonat-Dehydratase (RAD), einer D-Xylonat-Dehydratase (XAD) sowie einer α-Ketoglutarat-Semialdehyd-Dehydrogenase (KGSADH) nachgewiesen werden. Die Enzyme wurden partiell gereinigt und die kodierenden Gene mittels MALDI-TOF Massenspektroskopie identifiziert. Die Proteine wurden in H. volcanii überexprimiert und die rekombinanten Enzyme charakterisiert. Die RAD zeigte eine hohe Spezifität für D-Ribonat, dagegen setzte die XAD neben D-Xylonat auch D-Gluconat um, dabei wurde D-Gluconat mit einer signifikant höheren Aktivität umgesetzt. Die KGSADH katalysierte die Umsetzung von α Ketoglutarat-Semialdehyd zu α-Ketoglutarat. Die Ergebnisse zeigen, dass die identifizierten Enzyme aus H. marismortui an der Umsetzung von D-Xylonat und D Ribonat zu α Ketoglutarat beteiligt sind. D-Xyloseabbau in Halorhabdus utahensis In Extrakten von D-Xylose gewachsenen H. utahensis Zellen konnten die Aktivitäten der Schlüsselenzyme des oxidativen D-Xyloseabbaus, D-Xylose-Dehydrogenase und α Ketoglutarat-Semialdehyd-Dehydrogenase, nicht nachgewiesen werden. Dagegen wurden die Aktivitäten einer D-Xylose-Isomerase und einer D-Xylulose-Kinase gemessen, den typischen Enzymen des bakteriellen D-Xyloseabbaus zu D-Xylulose-5-Phosphat. Die putative D-Xylose-Isomerase, kodiert von Huta_2443, wurde in H. volcanii überexprimiert, gereinigt und charakterisiert. Das Enzym katalysierte die Isomerisierung von D-Xylose zu D Xylulose mit einer deutlich höheren katalytischen Effizienz als die Isomerisierung von D Glucose zu D-Fructose. Die Daten deuten darauf hin, dass das Haloarchaeon H. utahensis D-Xylose, wie die meisten Bacteria, mit einer D-Xylose-Isomerase und einer D Xylulose-Kinase zu D Xylulose-5-Phosphat abbaut und nicht oxidativ zu α-Ketoglutarat, wie H. volcanii und H. marismortui.

The pentose catabolism and its regulation are not studied well in the domain of archaea. Recent analyses revealed that the haloarchaeon Haloferax volcanii degrades D-xylose and L arabinose to α-ketoglutarate by an oxidative pathway. The initial reactions of this pathway are catalyzed by two distinct dehydrogenases, the D-xylose dehydrogenase and the L arabinose dehydrogenase. Further degradation of both D-xylonate and L-arabinoate to α ketoglutarate involves the same genes coding for D-xylonate dehydratase, 2-keto-3-deoxyxylonate dehydratase and α-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase. All genes of D xylose and L-arabinose catabolism form a cluster, which also contains genes coding for putative lactonase (HVO_B0030) and putative transcriptional regulator XacR (HVO_B0040). The functions of this putative lactonase and the regulator XacR have not been analyzed. In previous studies growth of Haloarcula marismortui on D-xylose and D-ribose was reported. The initial reaction of pentose degradation is catalyzed by a promiscuous D-xylose/ D-ribose dehydrogenase, indicating an oxidative pathway. The further enzymes involved in this pathway have not been identified so far. Comparative genome analyses with haloarchaeon H. utahensis, which also growth on D xylose, revealed that genes of an oxidative pathway are missing. Instead genes coding D xylose isomerase (Huta_2443) and D xylulose kinase (Huta_2446) are present, indicating that H. utahensis degrades D-xylose to D-xylulose-5-phosphate, as demonstrated for most bacteria. In this thesis the pentose degradation pathways were investigated in three haloarchaea. In H. volcanii the involvement of a lactonase in D-xylose and L-arabinose degradation was demonstrated. In addition the function of XacR as a transcriptional activator of genes involved in pentose degradation was characterized. The key enzymes of oxidative pentose degradation pathway were purified from H. marismortui cells and the coding genes were identified. The enzymes were expressed and the recombinant proteins were purified and characterized. The activities of D xylose isomerase and D xylulose kinase were measured in cell extracts of H. utahensis and recombinant D-xylose isomerase was purified and characterized. D-xylose and L-arabinose degradation in Haloferax volcanii Analyses and characterization of D-xylono-/ L-arabinolactonase. Transcript analyses of the gene HVO_B0030, encoding a putative lactonase, revealed a specific transcriptional induction by D-xylose and L arabinose as compared to D-glucose. HPLC analyses provided evidence that D-xylose dehydrogenase and L-arabinose dehydrogenase catalyzed the conversion of D-xylose to D xylonolactone and of L-arabinose to L-arabinolactone, respectively. The recombinant lactonase catalyzed the conversion of both lactones to the respective acids, D xylonate and L arabinoate. A chromosomal deletion mutant of the lactonase caused a restricted growth phenotype on L arabinose, which could be complemented with HVO_B0030 in trans. The data indicate that the lactonase encoded by HVO_B0030 is functionally involved in D-xylose and L arabinose degradation. This is the first report of a lactonase involved in pentose degradation in the domain of archaea. Transcriptional regulation of genes involved in D-xylose and L-arabinose degradation. Transcript analyses of genes involved in D-xylose and L-arabinose degradation revealed a transcriptional induction by both D-xylose and L-arabinose, indicating a common pentose specific transcriptional regulator. Adjacent to the gene cluster of pentose degradation, a putative transcriptional regulator XacR, encoded by HVO_B0040, was identified. To test whether XacR functions as transcriptional regulator of genes of D-xylose and L-arabinose catabolism, transcript levels of the pentose specific genes were compared in the wild type and the xacR deletion mutant. The transcripts of all pentose specific genes were detected after induction by pentoses only in the wild type and not in the XacR deletion mutant. This indicates that XacR is a transcriptional activator of genes involved in D-xylose and L arabinose degradation. A putative transcriptional activator binding site was identified by promoter analyses of D xylonate dehydratase. The promoter activity was measured with a reporter gene system following the activity of a ß galactosidase. Deletion mutagenesis of this promoter revealed a region of 11 bp upstream of the TATA-box to be essential for transcriptional activation. Deletion of this region caused loss of the ß galactosidase activity. Besides its activator function, XacR acted as repressor of its own synthesis, since xacR deletion resulted in an increase of xacR promoter activity. A palindromic sequence was identified in the xacR promoter and mutation of this sequence also resulted in an increase and thus derepression of xacR promoter activity. This leads to the conclusion that the palindromic sequence represents the binding site of XacR as repressor. This is the first report of a transcriptional regulator of pentose catabolism in the domain of archaea. D-xylose and D-ribose degradation in Haloarcula marismortui Extracts of D-xylose and D-ribose grown H. marismortui cells catalyzed the conversion of both D xylonate and D-ribonate to α-ketoglutarate. In addition activities of D ribonate dehydratase, D-xylonate dehydratase and α-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase were detected in cell extracts. These enzymes were purified and the coding genes were identified by MALDI TOF mass spectrometry. Furthermore, the recombinant enzymes were expressed in H. volcanii, purified and characterized. The D ribonate dehydratase was specific for D-ribonate, whereas the D-xylonate dehydratase catalyzed the conversion of both D-xylonate and D-gluconate, with a significant higher activity for D-gluconate. α-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase catalyzed the conversion of α-ketoglutarate semialdehyde to α-ketoglutarate. The data indicate the involvement of the identified enzymes in the conversion of D-xylonate and D-ribonate to α ketoglutarate. D-xylose degradation in Halorhabdus utahensis In extracts of D-xylose grown H. utahensis cells the activities of the key enzymes of the oxidative D-xylose degradation pathway of H. volcanii and H. marismortui, D-xylose dehydrogenase and α-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase, could not be detected. In contrast activities of D-xylose isomerase and D xylulose kinase, the typical enzymes of bacterial D-xylose degradation to D-xylulose-5-phosphate, were found. The putative D xylose isomerase encoded by Huta_2443 was expressed in H. volcanii and the recombinant enzyme was purified and characterized. The enzyme catalyzed the conversion of D-xylose to D xylulose with a significant higher catalytic efficiency than the conversion of D-glucose to D-fructose. The data indicate that H. utahensis degrades D-xylose to D-xylulose-5-phosphate involving D-xylose isomerase and D-xylulose kinase, as demonstrated for most bacteria.

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Sutter, Jan-Moritz: Pentosestoffwechsel in halophilen Archaea Abbauwege, Enzyme und transkriptionelle Regulation.

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