Proteome analyses for the characterization of the ADAM17ex/ex hypomorphic mouse model

Schönbeck, Benjamin John

The ectodomain shedding of numerous transmembrane proteins by the A Disintegrin And Metalloprotease 17 (ADAM17) governs a variety of physiological and developmental processes. Focusing on murine embryonic fibroblasts (MEFs) of ADAM17wt/wt and ADAM17ex/ex (hypomorphic) mice, we investigated ADAM17-mediated changes in conditioned cell culture supernatants, in membrane preparations and in whole cell lysates using a 2D-DiGE proteomic approach. The detection of high amounts of cleaved TNFα in supernatants of TNFα-overexpressing wild-type but not ADAM17ex/ex MEF cells demonstrated the general suitability of the employed 2D-DiGE approach for the identification of shed protein fragments. Interestingly, the analyses of whole-cell lysates revealed that ADAM17 might also influence intracellular protein levels since a variety of proteins (e.g. annexins) showed altered abundances at reduced levels of ADAM17. From conditioned MEF supernatants, seventy differentially abundant secreted and cell-surface proteins were identified. These included collagens and other extracellular matrix components, several proteases and several protein fragments. Thus, wild-type and ADAM17ex/ex MEF cells clearly differ in their ability to secrete or shed proteins. However, only fourteen different protein fragments showed altered abundances in ADAM17ex/ex MEF cell supernatants, including only two known ADAM17 substrates (TNFα and NCAM-1). Notably, most full length proteins that were detected as fragments lack a transmembrane region and are thus no bona fide ADAM17 substrates. The high amounts of the perlecan LG3 peptide and of the type-I collagen C-terminal propeptide in supernatants of wild-type MEF cells point to a reduced collagen maturation and degradation in ADAM17ex/ex MEF cells. Since we also observed reduced levels of the C-procollagenase “bone morphogenic protein 1” and reduced matrix metalloproteinase activity in ADAM17ex/ex MEF cell culture supernatants, the observed processing of collagen and perlecan might reflect “proteolytic side effects” by other proteases in a complex “protease web”.

Die Metalloprotease A Disintegrin And Metalloprotease 17 (ADAM17) vermittelt das Freisetzen der extrazellulären Domänen verschiedener Transmembranprotein (ectodomain shedding) und ist somit an verschiedensten physiologischen und entwicklungsbiologischen Prozessen beteiligt. Mit einem Fokus auf murine embryonale Fibroblasten (MEF) von ADAM17wt/wt und ADAM17ex/ex (hypomorphen) Mäusen haben wir ADAM17-abhängige Veränderungen in konditionierten Zellkulturüberständen, Membranfraktionen und Zelllysaten analysiert. Die Tauglichkeit der verwendeten 2D-DiGE Methode zur Identifizierung von Proteinfragmenten konnte dabei an Kulturüberständen von TNFα-überexprimierenden MEF-Zellen demonstriert werden. Im Gegensatz zu ADAM17ex/ex MEF-Zellen, konnten so in Kulturüberständen von wildtyp MEF-Zellen hohe Mengen an löslichem TNFα beobachtet werden. Darüber hinaus deutete die Analyse von Zelllysaten auch auf intrazelluläre Effekte von ADAM17 hin, da zahlreiche Protein (z.B. Annexine) veränderte Abundanzen unter reduzierter ADAM17 Aktivität zeigten. Aus konditionierten MEF-Kulturüberständen konnten siebzig differentiell abundante sekretierte und Zelloberflächenproteine identifiziert werden, darunter Kollagene und andere Komponenten der extrazellulären Matrix, verschiedene Proteasen und mehrere Proteinfragmente. Wildtyp und ADAM17ex/ex MEF-Zellen zeigen somit deutliche Unterschiede in Sekretion und Shedding von Proteinen. Insgesamt wurden jedoch lediglich vierzehn Proteinfragmente mit veränderter Abundanz in ADAM17ex/ex MEF-Zellen identifiziert, darunter zwei bekannte Substrate von ADAM17 (TNFα und NCAM-1). Interessanter Weise weisen die meisten Proteine, welche als Proteinfragmente identifiziert wurden keine Transmembrandomäne auf und sind somit kein bona fide ADAM17 Substrate. Der erhöhte Gehalt an dem Perlecan LG3-Peptid und dem C-terminalen Propeptid des Typ-I Kollagens in wildtyp MEF-Kulturüberständen deutet daneben auf eine Verminderte Reifung und Degradierung von Kollagenen in ADAM17ex/ex MEF-Zellen hin. Da wir außerdem eine reduzierte Abundanz der C-Procollagenase „bone morphogenic protein 1” und verminderte Matrixmetalloprotease-Aktivitäten in Kulturüberständen von ADAM17ex/ex MEF-Zellen beobachteten, könnten die beobachtete Veränderung der Kollagen- und Perlecanprozessierung ein “proteolytischer Nebeneffekt” durch andere Proteasen in einem komplexen „proteolytischen Netzwerk“ sein.

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Schönbeck, Benjamin: Proteome analyses for the characterization of the ADAM17ex/ex hypomorphic mouse model. 2014.

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