PLGA-Nanopartikel für die inhalative Vakzinierung

Janke, Julia

Die vorliegende Arbeit umfasst die Entwicklung und Charakterisierung einer Vakzinformulierung für die pulmonale Applikation. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden Nanopartikel aus dem Polymer PLGA hergestellt und mit dem Modellantigen Ovalbumin beladen. Durch Sprühtrocknung wurden die Nanopartikel in ein trockenes Produkt überführt, das sich nach Dispergierung mit einem Inhalator für die pulmonale Applikation eignete. Mithilfe von in-vitro Untersuchungen wurde ermittelt, ob die Formulierungen eine Immunreaktion auslösen. Zusätzlich wurde die Zytotoxizität an einer Lungenkarzinomzelllinie geprüft. Die PLGA-Nanopartikel wurden mit zwei unterschiedlichen Verfahren hergestellt: Der Solvent Change Präzipitation und der Doppelemulsionsmethode. Dabei wurde das Ziel verfolgt, Partikel mit einer Größe zwischen 200 und 400 nm zu erzeugen. Damit besaßen die Partikel eine ähnliche Größe wie Bakterien, was eine effektive partikuläre Aufnahme durch immunkompetente Zellen der Lunge, wie zum Beispiel Alveolarmakrophagen und dendritische Zellen, ermöglicht. Mit beiden Methoden ließen sich reproduzierbar Nanopartikel im Bereich von 300 nm herstellen. Allerdings hatte die Solvent Change Präzipitation den Nachteil, dass das Antigen ausschließlich auf der Oberfläche adsorbiert werden konnte und somit nicht vor äußeren Einflüssen geschützt war. Im Gegensatz dazu konnte das Antigen bei der Doppelemulsionsmethode effektiv in die Partikel verkapselt werden. Jedoch wurde eine ungenügende Freisetzung des verkapselten Antigens innerhalb von 24 Stunden beobachtet. Gelöst wurde dies durch die Entwicklung von porösen Nanopartikeln, die den Vorteil boten, dass das Antigen im Inneren verkapselt vorlag, aber durch die Poren effektiver als bei soliden Partikeln freigesetzt werden konnte. Die freigesetzte Antigenmenge konnte mit diesem Ansatz erfolgreich von etwa 8% auf 36% gesteigert werden. Da sich die Nanopartikel selbst, aufgrund ihrer geringen Größe, nicht für die pulmonale Applikation eignen. wurden sie durch Sprühtrocknung in ein trockenes mikropartikuläres Pulver überführt. Dabei diente der Stabilisator, der bereits während der Nanopartikelherstellung genutzt wurde, als Matrix, in die die Nanopartikel eingebettet wurden. HPMC und PVA waren für den Zweck der Stabilisierung und Sprühtrocknung besonders geeignet. Die Herstellung des sprühgetrockneten Pulvers wurde dahingehend optimiert, dass eine aerodynamische Partikelgröße zwischen 0,5 und 5 µm erzielt wurde. In diesem Größenbereich können Partikel in die Lunge gelangen und dort abgeschieden werden. Abgesehen von der Größe ist für eine erfolgreiche pulmonale Applikation die Verwendung eines Inhalators erforderlich. Zu diesem Zweck wurden Untersuchungen mit zwei kapselbasierten Trockenpulverinhalatoren, dem Cyclohaler und dem Unihaler, durchgeführt und die Dispergiereigenschaften der beiden Inhalatoren sowie die aerodynamischen Eigenschaften der dispergierten Formulierung ermittelt und miteinander verglichen. Im Kontakt mit Feuchtigkeit, wie zum Beispiel in der Lunge, löste sich die Stabilisatormatrix auf und gab die Nanopartikel frei. Diese besaßen noch die gleiche Größe wie vor der Sprühtrocknung, womit sie potentiell für die Aufnahme durch immunkompetente Zellen der Lunge geeignet waren. Nach der Aufnahme ins Zellinnere soll das Antigen aus den Partikeln freigegeben und anschließend prozessiert werden, um eine Immunreaktion zu bewirken. Die immunologischen in-vitro-Untersuchungen bewiesen, dass es zur Aufnahme der Partikel kam und eine Immunreaktion ausgelöst wurde. Dabei lösten die partikulären Antigen-formulierungen eine stärkere Immunreaktion als das gelöste Antigen aus. In der Zellkultur wurde zusätzlich die Zytotoxizität sowohl der eingesetzten Formulierungsbestandteile als auch der finalen Formulierung an Calu-3-Zellen, einer Lungenkarzinomzelllinie, überprüft. Es wurde festgestellt, dass die finale Formulierung keine toxischen Effekte auf die Calu-3-Zellen auslöste und auch alle Formulierungsbestandteile in einer unbedenklichen Konzentration vorlagen. Abschließend wurde die Stabilität der Formulierung bei Lagerung über 6 Monate unter Umgebungsbedingungen (21°C und 32% rF) getestet. Dabei kam es zu einer leichten Abnahme des Antigengehalts und einer geringfügige Zunahme der durchschnittlichen Nanopartikelgröße. Die Nanopartikel besaßen aber weiterhin eine Größe, die die Aufnahme durch immunkompetente Zellen ermöglichte. Darüber hinaus blieben die Partikelgrößenverteilung wie auch die aero-dynamischen Eigenschaften der Formulierung über die Lagerzeit unverändert. Es gelang, eine Formulierung zu entwickeln, die geeignet ist, ein Antigen pulmonal zu applizieren. Damit stellt diese Formulierung eine Plattform dar, mit der nun unterschiedliche Antigene pulmonal appliziert werden können. Dabei wäre neben der therapeutischen, ebenfalls eine präventive Vakzinierung denkbar. Mithilfe von in-vivo-Studien sollte nun überprüft werden, ob die in-vitro festgestellten Effekte ebenfalls in-vivo zu detektieren sind.

This work describes the development and characterisation of a formulation which is suitable for vaccination via the respiratory tract. Nanoparticles were produced by using PLGA as polymer and loaded with ovalbumin as model antigen. By spray drying the nanoparticles were transferred to a dry powder which was suitable for inhaler dispersion and for application into the lung. In vitro tests were used to determine immunologic effects of the formulations. Furthermore, the cytotoxicity of the formulations was tested by using a bronchial adenocarcinoma cell line. Two methods were used in this work for nanoparticle production, on the one hand a solvent change precipitation and on the other hand a double emulsion technique. Thereby nanoparticles in the size range between 200 and 400 nm should be achieved. This scale is similar to bacteria size ranges. Hence an effective particulate uptake by immune cells in the lung, for example alveolar macrophages and dendritic cells, was possible. Both above mentioned methods were reproducibly applicable to produce particles of around 300 nm in diameter. In case of the solvent change precipitation the antigen was just adsorbed at the surface of the particles with the disadvantage of a poor protection against external influences. In contrast the double emulsion technique enabled an effective antigen encapsulation. However this included the disadvantage of a very low antigen release within the first 24 hours which was controlled by the degradation of the polymer. To address this issue porous nanoparticles were developed which comprise both the advantages of antigen encapsulation in the particle as well as a better antigen release. With this approach it was possible to increase the antigen release from 8% for solid up to 36% for porous particles. The nanoparticles themselves were not suitable for application to the respiratory tract due to their small size. Therefore they were transferred by spray drying into a dry powder. The stabiliser which was used for particle production acted during spray drying as a bulking agent in which the nanoparticles were embedded. HPMC and PVA were both particularly suitable for nanoparticle stabilisation as well as for spray drying. The spray dried powder production process was optimised to obtain particles in the aerodynamic size range between 0.5 and 5 µm which enables the particles to reach the lung. Application to the respiratory tract requires an inhalation device. Cyclohaler and Unihaler, both being capsule based dry powder inhalers, were used in order to determine the dispersion properties of the inhalers as well as the aerodynamic behaviour of the dispersed formulation. In contact with moisture, as for example present inside the lung, the matrix dissolved and the nanoparticles were redispersed. These nanoparticles showed the same particle size as prior to the spray drying process step. This allows the uptake by immune cells of the lung. After nanoparticle uptake the antigen shall be released from the nanoparticles and be processed, followed by an immune response. The immunologic in-vitro tests demonstrated particle uptake by cells as well as the appearance of immune responses. Thereby the particulate antigen show an improved response compared to the dissolved antigen. Furthermore, the cytotoxicity of the final formulations and the individual formulation components was tested by using Calu-3 cells which represent a bronchial adenocarcinoma cell line. No toxic effects were detected for the final formulations and the components were also found to exist only in harmless concentrations. Finally, a stability test was performed during 6 months storage on ambient conditions (21°C and 32% rH) resulting in a minor decrease in antigen content and a slight increase in nanoparticle size. The nanoparticles were still in the suitable size range for uptake by dendritic cells and macrophages. Furthermore, microparticle size distribution and aerodynamic behaviour of the formulation showed no differences. The development of a formulation for vaccination via the respiratory was successfully performed. The produced formulation represents a platform which is suitable for pulmonary application of different antigens. The use as a formulation for therapeutic as well as for preventive vaccination is conceivable. The next steps should comprise in-vivo studies for proofing the in-vitro results.

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Janke, Julia: PLGA-Nanopartikel für die inhalative Vakzinierung. 2014.

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