Entwicklung molekularbiologischer Methoden und Aufbau einer Datenbank zur Identitäts-, Mischlings- und Abstammungsanalyse ausgewählter Tierarten

Modrow, Jan-Hendrik

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene molekulargenetische Methoden zur Erstellung eines genetischen Profils ausgewählter Spezies entwickelt. Mithilfe dieser wurden Identitäts- und Abstammungs- sowie bei Hund, Pferd und Katze ergänzend Mischlingsanalysen durchgeführt. Zusätzlich wurde eine Datenbank etabliert, um die notwendige Grundlage für die biostatistische Analyse zu schaffen. Bei Hund und Pferd wurde auf kommerziell erhältliche Kits von Applied Biosystems® und Finnzymes® zurückgegriffen. Für die Katzen wurde auf Basis einer Veröffentlichung aus 2002 (Butler, et al., 2002) eine Multiplex-PCR angepasst und weiterentwickelt. Für die Spezies Koi-Karpfen, Kaninchen und Kamel wurden mithilfe von Whole Genome Scans mit einer selbst-entwickelten Software Primer ausgewählt, diese mit dem Blast Algorithmus des The National Center for Biotechnology Information validiert und entsprechende Multiplex-PCRs entwickelt und etabliert. Alle Probenentnahmen sollten möglichst wenig invasiv und stressfrei für die Tiere ablaufen, sodass die Extraktion der DNA im Regelfall aus Abstrichen der Mundschleimhaut oder bei den Koi-Karpfen aus Abstrichen des Körperschleims erfolgte. Das Problem der Kontamination durch PCR-Inhibitoren aus Pflanzenmaterial konnte mithilfe eines speziellen Extraktionskits für Pflanzenmaterial kompensiert werden. Zusätzlich standen Gewebe- und Blutproben zur Verfügung, die während Routineuntersuchungen mit Einverständnis der Tierhalter von verschiedenen Tierärzten zur Verfügung gestellt wurden. Als weitere forensische Anwendung wurde eine Multiplex-PCR zur Speziesidentifikation entwickelt, um den tierischen Ursprung unbekannter Proben, aber auch zubereiteter Fleischprodukte zu bestimmen. Hierbei wurden zunächst zwei einzelne Multiplexes, die Wild-Plex für Wildschwein, Feldhase, Trug- und Hirschartige sowie den Dachs und die Farm-Plex für Rind, Schaf, Ziege, Pferd und Hausschwein entwickelt, die jedoch auch zu einer alle Tiere umfassenden Meat-Plex zusammengefasst werden können. Insgesamt wurden 405 Hunde (Identität, Abstammung, mtDNA, Mischlingsanalyse, Verhaltensanalyse), 133 Pferde, 10 Koi-Karpfen, 123 Katzen, 10 Kaninchen und 10 Kamele und Alpakas sowie 60 Fleisch- und Gewebeproben bei der Speziesidentifikation untersucht. Aus den gesamten DNA-Profil Daten wurde mithilfe des Software-Moduls AllelFi© (MeMo Forensics, 2014) sowohl für die verschiedenen Rassen Allelfrequenzen als auch gepoolte Allelfrequenzdaten erstellt. Diese wurden für die weitere Auswertung im Identitätsrechner CalcSTR© (MeMo Forensics, 2014) und für die genetische Assoziationsanalyse im MischSTR© (MeMo Forensics, 2014) zur Bestimmung der jeweiligen Rasse verwendet. Bei allen untersuchten Probenkollektiven mit n>100 wurden Allelfrequenzdaten generiert, deren Diskrimierungsrate für die einzelnen Rassen mindestens bei 84 %, gepoolt stets über 99 % lag. Aufgrund der bisher niedrigen Individuenzahl ließ sich für Koi-Karpfen, Kaninchen und Kamele keine repräsentative Allelverteilung erstellen, jedoch lässt sich die für Hund, Pferd und Katze etablierte Methodik problemlos auf diese Spezies übertragen. Einzig die Abstammungs- und Identitätsanalytik beim Koi-Karpfen könnte aufgrund von ggf. auftretender Triallelität erschwert werden, jedoch zeigten die bisher untersuchten Individuen, inklusive der drei untersuchten Wildformen, dieses Phänomen nicht. Weiterhin erwies sich die Sequenzanalytik mitochondrialer DNA bei 51 Hunden als nicht nutzbar für die Mischlingsanalytik, da keine rassespezifischen Mutationen detektierbar waren, mit denen sich adäquat zwischen den Tieren unterscheiden ließ. Hier war die STR-Assoziationsanalyse das Mittel der Wahl. Aufgrund der höheren Diskriminierungsrate von compound und complex Wiederholungseinheiten im Stockmarks™ for Dogs Canine Kit (Applied Biosystems®) gegenüber Dinukleotidwiederholungen im Finnzymes™ Canine Panel 1.1 (Thermo Scientific®), eignete sich dieses besser für die STR-basierte Mischlingsanalyse. Ergänzt durch die Phänotypanalyse ließ sich mithilfe des Stockmarks™ Kits für alle Mischlinge eine reproduzierbare Beurteilung durchführen. Die entwickelte Multiplex-PCR mit vier untersuchten Systemen zur Verhaltens- und Aggressionsanalyse erwies sich als sehr guter Ansatz zur genetischen Bestimmung der Stellungsfähigkeit und Prädispositionsbestimmung für aggressives Verhalten des Hundes. Insgesamt wurde ein Kollektiv von 250 bereits kategorisierten Tieren untersucht. Bei Blindproben konnte mithilfe der Assoziationsanalyse stets mindestens die Hauptgruppe der Stellungsfähigkeit sowie, sofern angegeben, eine genetische Prädisposition für aggressives Verhalten bestimmt werden. Ergänzend zum genetischen Fingerabdruck beim Koi-Karpfen wurde eine bereits veröffentlichte Methodik zur Geschlechtsbestimmung beim Karpfen (Chen, et al., 2009) auf eine Immolase-basierte PCR umgewandelt und konnte erfolgreich bei allen untersuchten Kois eingesetzt werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnten verschiedene Multiplex-PCRs validiert und (weiter-)entwickelt werden, die sich sehr gut als Werkzeug zur Abstammungs-, Identitäts- und Mischlingsanalyse verschiedener Spezies eignen. Zusätzlich wurde eine Datenbank mit genetischen Profilen verschiedener Rassen etabliert und eine Auswertesoftware entwickelt bzw. validiert, die computergestützt komplizierte biostatistische Assoziations- sowie Identitätsanalysen auswertet und aus DNA-Profilen Allelfrequenzdaten erstellen kann.

In this study various molecular genetic methods were developed to create a genetic profile of selected species. Additionally, these methods were used to perform identity, parentage and for dogs, cats and horses pedigree analysis. In addition, a database has been established to provide the necessary basis for biostatistical analysis. For dog and horse analysis commercially available STR kits from Applied Biosystems® and Finnzymes® were used. The multiplex PCR for the analysis of cats were based on a publication from 2002 (Butler, et al. 2002), adapted and further developed. The primers for the species koi carp, rabbit and camel were chosen by Whole Genome Scans with a self-developed software. These were validated with the Blast algorithm of the National Center for Biotechnology Information and combined to a multiplex PCR. The sampling procedure should be as non-invasive and stressless for the animals as possible. Therefore, in most cases the DNA was extracted from buccal or for koi carps from body mucus swabs. The problem regarding a contamination with PCR inhibitors from plant material could be minimized using a special DNA extraction kit for plant materials. Additionally, tissue and blood samples were provided by several vets. The samples were taken during routine examinations with the approval of the animal owners. Furthermore, a multiplex PCR for the species identification was developed as a further forensic application. This method is not only usable to determine the originator of unknown tissues samples but also to identify the species used in processed meat products. Therefore, two individual multiplex PCRs were developed: the Wild-Plex for the identification of boar, hare, badger and the cervidae family and the Farm-Plex for common livestock such as cattle, goat, sheep horse and pig. Both PCRs can be combined in the Meat-Plex. Collectively 397 dogs, 137 horses, ten koi carps, 125 cats, ten rabbits and 25 camels and alpakas as soon as 60 meat and tissue samples for the species identification were investigated. Using the collected DNA profile datasets allele frequency data for the specific breeds as well as pooled allele frequencies were generated using the self-developed AllelFi© software module. The generated allele frequencies were used for further analysis using the identity calculator CalcSTR© and MischSTR© (both MeMo Forensics, 2014) module for genetic association analysis to determine the breed. Allele frequency datasets were generated for all sample collectives with n>100. The power of discrimination for the individual breeds was at minimum 84 %, for pooled population continuously over 99 %. Because of the low amount of investigated individuals it was not possible to compile representative allele distributions for the koi carps, rabbits and camels. But the established methods used for the dogs, horses and cats are fully transferable to these species. Only the determination of the identity and parentage for the koi carps might be tricky, because of the possibility of triallelity. In this thesis none of the investigated individuals as well as the three probed wild carps showed this phenomena. The sequencing of mitochondrial DNA of 51 dogs was not applicable for the genetic determination of the breed. It was not possible to detect breed specific mutation which might be usable to differentiate between the dog breeds. For this application the STR association analysis was the best choice. Regarding to the high power of discrimination of compound and complex repeats of the STR systems used in the Stockmarks™ Dogs for Canine Kit (Applied Biosystems®) in contrast to the dinucleotide repeats of the STR systems used in the Finnzymes™ Canine Panel 1.1 (Thermo Scientific®) the Stockmarks™ Kit was more adequate for the STR based breed application. The developed multiplex PCR of four genetic systems for the investigation of behavior and pack position proved to be an adequate approach to determine the pack position and a genetic predisposition for aggressive behavior of dogs. A collective of 250 categorized individuals were investigated. Analyzing unknown samples using this association analysis it was possible to determine the main group of the pack position at minimum. In addition to the genetic fingerprint of the koi carp a published method (Chen, et al. 2009) for the gender determination was adapted to an Immolase based PCR assay and could be applied successfully to all investigated individuals. During this PhD thesis several multiplex PCRs could be validated and (further) developed which could be used as an adequate tool for the parentage, identity and breed analysis. Additionally, a database of genetic profiles from different species and breeds was established. An evaluation software was developed which allows the computational, biostatistical analysis of complicated genetic association and identity analysis and the generation of allele frequencies from DNA profiles.

Preview

Quote

Citation style:

Modrow, Jan-Hendrik: Entwicklung molekularbiologischer Methoden und Aufbau einer Datenbank zur Identitäts-, Mischlings- und Abstammungsanalyse ausgewählter Tierarten.

Rights

Use and reproduction:
No CC License (german copyright law applies)

Export