Die Komponenten des mARC-Enzymsystems im N-reduktiven Metabolismus humaner Zellen

Plitzko, Birte

Die mitochondriale Amidoxim reduzierende Komponente mARC ist ein erst kürzlich entdecktes Molybdoenzym, das zusammen mit den Elektronentransportproteinen Cytochrom b5 (CYB5) und NADH-Cytochrom b5 Reduktase (CYB5R) in vitro die Redukti-on diverser N hydroxylierter Verbindungen katalysiert. Daher ist allgemein anerkannt, dass das mARC-haltige Enzymsystem für die Aktivierung von N hydroxylierten Amidin- und Guanidin-Prodrugs und für die Entgiftung toxischer Hydroxylamine verantwortlich ist. Alle bisher hierauf analysierten Säugetier-Genome codieren für zwei mARC-Proteine, die eine hohe Sequenzähnlichkeit aufweisen. Mit RNAi Experimenten in humanen Zellen konnten in dieser Arbeit die für den Zellmetabolismus essentiellen Komponenten des N reduktiven Systems identifiziert werden. Dabei wurde erstmals gezeigt, dass beide mARC-Proteine im Zellmetabolismus die Fähigkeit haben N hydroxylierte Substrate zu reduzieren, dass aber das Ausmaß der Beteiligung stark vom Expressionslevel des jeweiligen mARC-Proteins abhängig ist. Des Weiteren wurde das mitochondriale CYB5B als essentielle Komponente identifiziert, während die Beteiligung der mikrosomalen CYB5-Isoform ausgeschlossen werden konnte. CYB5R3 wurde als die für den N reduktiven Metabolismus relevante Reduktase ermittelt. Untersuchungen mit Apo-CYB5B zeigen, dass die N Reduktion strikt vom CYB5-Häm abhängig ist, so dass für CYB5 innerhalb des N reduktiven Systems eine Funktion als Elektronentransportprotein angenommen werden kann. Mittels des etablierten mARC-Knockdowns wurde untersucht, ob die im rekonstitu-ierten System beobachtete Detoxifizierung des mutagenen Nukleobasenanalogons 6 N Hydroxyadenin (HAP) und des Nukleosidanalogons 6 N Hydroxyadenosin (HAPR) durch das mARC-haltige N reduktive Enzymsystem im humanen Zellsystem einen relevanten Entgiftungsweg darstellt. Für HAP wurde eine mARC-abhängige N reduktive Entgiftung in HEK 293 Zellen nachgewiesen. Für HAPR wurde unterdessen gezeigt, dass die Metabolisierung zu Inosin nur in geringem Maße über eine mARC-vermittelt N Reduktion zum Intermediat Adenosin verläuft, sondern primär direkt von der Adenosindesaminase katalysiert wird. Zur Detektion HAP-induzierter Apoptose wurden zwei Assays etabliert. Es zeigte sich, dass mARC2 HeLa Zellen vor den apoptotischen Effekten des Basenanalogons schützen kann, während mARC1 bei der reduktiven Detoxifizierung von HAP in HeLa Zellen scheinbar keine entscheidende Rolle spielt.

The mitochondrial Amidoxime Reducing Component mARC is a recently discovered molybdenum containing enzyme. In vitro mARC catalyzes, together with the electron transport proteins cytochrome b5 (CYB5) and NADH-cytochrome b5 reductase (CYB5R), the reduction of various N hydroxylated compounds. Therefore, the mARC-containing enzyme system is considered to be responsible for the activation of amidoxime- and N hydroxylated guanidine-prodrugs and for the detoxification of toxic hydroxylamines. All hitherto analyzed mammalian genomes code for two mARC proteins, which share a high sequence similarity. In this study the essential components of the N reductive system in cell metabolism were identified by RNAi experiments in human cells. Thereby, it could be demonstrated for the first time that both mARC proteins are capable of reducing N hydroxylated substrates in cell metabolism. However, the extent of their involvement is highly dependent on the expression level of the particular protein. Furthermore, the mitochondrial isoform of CYB5 (CYB5B) was clearly identified as an essential component, whereas the involvement of the microsomal isoform (CYB5A) could be excluded. CYB5R3 was determined to be the relevant reductase for N reductive metabolism. Using apo-CYB5B N reductive catalysis was proven to strictly depend on CYB5-heme. Therefore, it can be assumed that CYB5B functions as an electron transport protein within the N reductive system. By applying the established mARC-knockdown it was tested whether the mARC-containing N reductive enzyme system could play a significant role in detoxification of the mutagenic nucleobase analog 6 N hydroxyadenine (HAP) and the nucleoside analog 6 N hydroxyadenosine (HAPR) in human cell metabolism. The mARC-dependent N reductive conversion of HAP in HEK 293 could be demonstrated. For HAPR, on the other hand, it was shown that its metabolism to inosine is only to a small extent mARC-mediated via the N reduction to adenosine as an intermediate. In fact, a direct dehydroxylamination of HAPR is catalyzed by adenosine deaminase. Two assays were established for the detection of HAP-induced apoptosis. Using these assays mARC2 was shown to protect HeLa cells against the apoptotic effects of the base analog, whereas the involvement of mARC1 in reductive detoxification of HAP does not seem to be pivotal.

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Plitzko, Birte: Die Komponenten des mARC-Enzymsystems im N-reduktiven Metabolismus humaner Zellen. 2014.

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