Das BEM46 Protein in Neurospora crassa : Eisosomale Lokalisation und Verknüpfung mit der Tryptophan-abhängigen Auxin-Biosynthese

Kolláth-Leiß, Krisztina

In allen Genomen von eukaryotischen Organismen wird mindestens ein BEM46-Homolog kodiert, jedoch ist die genaue Funktion des Proteins bisher weitgehend unklar. Die geringe über das BEM46 Protein publizierte Datenmenge lässt vermuten, dass BEM46 eine Rolle im polaren Wachstum spielt. Da Ascomyceten als Modellsystem für polares Wachstum fungie-ren, konzentrieren sich die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit auf das BEM46 Protein in Neurospora crassa. In früheren Studien wurden zwei bem46-transformante N. crassa-Stämme (RNAi-vermittelte knock-down- und Überexpressions-Transformante) hergestellt und zum Teil phänotypisch untersucht. Die Transformanten zeigten eine auf 0% reduzierte Ascosporen-Keimungsrate mit einzelnen so genannten survival Meiosporen, die ihre Fähigkeit zum polaren Wachstum verloren haben. Nach erfolgreicher Herstellung einer knock-out-Mutante wurden die phäno-typischen Analysen aller transformanten und mutanten Stämme wiederholt und ausgeweitet. Die Ascosporen-Keimungsrate der knock-out-Linie ist um 50% reduziert. Das vegetative My-zelium der Transformanten und der Mutante zeigt normales Hyphenwachstum und Konidio-phor-Bildung, jedoch sind die Konidienkeimung und das Wachstum der jungen Hyphen von der bem46-Expression beeinflusst. Die Anthranylat-Synthase Komponent II (trp-1), die als Enzym einen Schritt der Tryptophan-Biosynthese katalysiert, wurde als Interaktionspartner des BEM46 Proteins in N. crassa identifiziert. Die Interaktion wurde durch bimolekulare Fluo-reszenzkomplementation (split-YFP) in vivo bestätigt. Tryptophan dient als Vorläufer diverser Botenstoffe darunter Auxin. Da die Publikationen zur Auxin-Produktion in N. crassa nicht über die herkömmlichen Datenbanken erhältlich sind, waren die Ergebnisse in der gegen-wärtigen Forschung nicht bekannt. Folglich wurde im ersten Schritt die Fähigkeit des N. crassa Wildtyp-Stammes zur Auxin-Biosynthese untersucht und mit Hilfe von indirektem (mit Hilfe von DR5::GUS A. thaliana Pflanzen) und direktem (mit Hilfe von Dünnschichtchromato-graphie) Verfahren nachgewiesen. Durch bioinformatische Analysen wurde ein putativer Au-xin-Biosyntheseweg in N. crassa identifiziert. Die relative Indolproduktion der Δtrp-1- (erhalten über FGSC) und Δbem46-Mutante sowie der bem46-Transformanten wurde in diversen Entwicklungsstadien ermittelt. Während der Keimungsphase der Asco- und Konidiosporen produzieren die mutanten und transformanten Stämme Auxin in signifikant unterschiedlichen Mengen. Die Expression der für die Enzyme des putativen Biosyntheseweges kodierenden Gene ist auch signifikant abweichend (Bönniger 2013). Die Untersuchungen führen zu dem Ergebnis, dass das BEM46 Protein mit der Auxin-Biosynthese von N. crassa verknüpft ist. Obwohl die Ergebnisse eine Verbindung zwischen BEM46 und der Auxin-Biosynthese in N. crassa postulieren, scheint die Interaktion komplex und der Wirkungsmechanismus bleibt unbekannt. Mit Hilfe von PCR und einer anschließenden Sequenzierung wurden Hinweise auf alternati-ves Spleißen des bem46-Transkripts in N. crassa gewonnen. Die Wirkung der alternativen Fragmente wurde untersucht und es wurde gezeigt, dass sie für die Reduktion der Ascospo-renkeimung in den Transformanten und in der Mutante verantwortlich sind. Der Einfluss der kleinen Transkripte auf die Indolproduktion wurde auch beobachtet. Es wurde gezeigt, dass das BEM46 Protein von N. crassa in dem endoplasmatischen Reti-kulum sowie in den Eisosomen lokalisiert ist. Auch der neutrale Aminosäuren-Transporter MTR wurde in den Eisosomen von N. crassa nachgewiesen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten darauf hin, dass das BEM46 Protein von N. crassa an dem Kreuzungspunkt von Tryptophan-Aufnahme und intrazellulärer Tryptophan-abhängiger Auxin-Biosynthese agiert und über die Auxin-Produktion das polare Wachstum des Pilzes abhängig von den Entwicklungsstadien beeinflusst.

Although every eukaryotic organism possesses at least one gene coding for a BEM46 homo-logues protein, the function of BEM46 is not fully understood. Limited information has been published about BEM46 in different organisms, but all of these suggest a function of BEM46 in maintaining polar growth. Hence, ascomycetes serve as a model system for polar growth: Our investigations focus on the BEM46 protein of Neurospora crassa. In former studies, two bem46 transformant strains (RNAi mediated knock-down and overex-pression transformants) were generated and partly phenotypically analysed. The trans-formants show a loss of ascospore germination with a typical loss-of-polarity phenotype, ob-served by single survival ascospores. After successfully generating the bem46-knock-out mutant strain, the phenotypical analyses were extended and repeated. The bem46 mutant strain shows only a slight reduction of ascospore germination. Vegetative mycelia of bem46 transformant and mutant strains show normal hyphal and conidiophore development. How-ever, conidial germination and elongation of young hyphae is influenced by bem46 expres-sion. The anthranilate synthase component II (trp-1), an enzyme that catalyses a step in the tryptophan-biosynthesis, was identified as an interacting partner of BEM46 in N. crassa. The interaction was confirmed by bimolecular fluorescence complementation (split-YFP) assay. Tryptophan acts amongst others as a precursor for several messenger substances including auxin. As the publications about auxin production in N. crassa are not available in common databases, the results of these studies have not been established in actual scientific research. Therefore, the auxin biosynthetic capability of N. crassa wild type strain was verified by direct (thin layer chromatography) and indirect (using A. thaliana DR5::GUS seedlings) approaches. A putative biosynthetic pathway was identified using bioinformatics tools. The relative indole production of the ∆trp-1 (available at FGSC) and ∆bem46 mutants, as well as the bem46 transformant strains, was determined in different developmental stages of N. crassa. During the germination of asco- and conidiospores, the auxin production significantly varied in the different strains. The expression of the genes coding for the enzymes of the putative biosynthetic pathway was also significantly altered (Bönniger 2013). The analyses led to the result that there is a connection between BEM46 and auxin biosynthesis in N. crassa. Although, an influence of BEM46 on the auxin production of N. crassa seems to be evident, the way in which it reacts appears to be complex and remains elusive. Evidence for an alternative splicing of the bem46 transcript in N. crassa was provided by PCR and subsequent sequencing. The influence of the alternative spliced products was in-vestigated and results showed that the alternative fragments are responsible for the loss of ascospore germination in the transformant strain. In addition, their influence on the indole production was observed. It was shown that BEM46 of N. crassa is localised to the perinuclear endoplasmic reticulum and to the eisosomes. An additional protein, the neutral amino acid transporter MTR, was also detected in the eisosomes. Based on the results of the investigations, it is hypothesised that BEM46 acts at the crossing point of indole uptake and biosynthesis in N. crassa. Additionally, it influences polar growth in different developmental stages, by affecting the auxine production of the fungus.

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Kolláth-Leiß, Krisztina: Das BEM46 Protein in Neurospora crassa : Eisosomale Lokalisation und Verknüpfung mit der Tryptophan-abhängigen Auxin-Biosynthese.

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