Analyses of melittin-induced ADAM10 and -17-activation and of phosphatidylserine exposure for ADAM17-mediated substrate processing

Sommer, Anselm

In the second part of this thesis, the role of phosphatidylserine exposure on ADAM17-mediated shedding was analyzed. Phosphatidylserine is a negatively charged phospholipid, which is primarily localized at the cytoplasmic site of membrane bilayers. Upon activation of scramblases or inhibition of flippases, phosphatidylserine can rapidly be exposed, a process often, but not exclusively associated with apoptosis. It could be shown in this thesis, that all tested ADAM17-stimuli induce phosphatidylserine scrambling in cells. This exposure was, except for ionomycin, temporary and transient. Moreover, phosphatidylserine exposure correlated with ADAM17- mediated ERK1/2 phosphorylation and could be inhibited by specific inhibitors, which inhibit the signaling cascades that lead to ADAM17 activation. The correlation of phosphatidylserine exposure and ADAM17-mediated shedding was additionally proven by either decreasing the cellular phosphatidylserine content in cells and by inhibiting the exposure with the stilbene derivates DIDS and SITS. Like other phosphatidylserine binding proteins, ADAM17 contains a polybasic amino acid cluster (R625K626XK628), which is located in the extracellular membrane proximal domain. In in vitro binding assays it was shown that this domain binds to phosphatidylserine- but not to phosphatidylcholine-liposomes. Competition for the phosphatidylserine binding of ADAM17 with the soluble head group of phosphatidylserine OPLS, competitively inhibited ADAM17-mediated shedding...

Die “A Disintegrin and Metalloproteases” (ADAM) -10 und -17 spielen eine entscheidende Rolle in vielen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen. Sie sind verantwortlich für die Freisetzung verschiedenster Transmembranproteine wie zum Beispiel Cadherine, Selektine, TNF-α, EGFR-Liganden und die Rezeptoren für VEGF und TNF-α. Aufgrund dieser Vielzahl an Substraten ist es notwendig, dass die proteolytische Aktivität von ADAM10 und -17 genau reguliert ist. Diverse physiologische Stimulanzien können diese proteolytische Aktivität sehr schnell erhöhen. Obwohl die Mechanismen, die der proteolytischen Aktivität von ADAM10 und -17 zu Grunde liegen, kaum verstanden sind, zeigen einige Studien, dass insbesondere eine Steigerung der intrazelluläre Ca2+-Konzentration, Kinase Aktivierungen und Interaktionen mit Protein-Bindungspartnern daran beteiligt sind. Interessanterweise sind die zytoplasmatischen Domänen von ADAM10 und auch ADAM17 für das stimulierte Shedding nicht notwendig. Deshalb können intrazelluläre Modifikationen von ADAM10 und -17 nicht die Ursache für die schnelle Aktivierung der Protease-Aktivität sein. Stattdessen könnte die Membran eine wichtige Rolle spielen, da unter anderem gezeigt wurde, dass die Membranfluidität die Sheddingrate beeinflusst. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, den Einfluss von Membranveränderungen auf das von ADAM10 und -17 vermittelte Shedding näher zu untersuchen. Im ersten Teil der Arbeit wurde der Einfluss von Melittin auf die von ADAM10 und -17 vermittelte Substrat-Freisetzung untersucht...

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Sommer, Anselm: Analyses of melittin-induced ADAM10 and -17-activation and of phosphatidylserine exposure for ADAM17-mediated substrate processing.

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