Indirect effector mechanisms on antibodies in hemodialysis patients

Koch, Till Jakob

Patients suffering from chronic kidney failure undergoing regular hemodialysis (DP) have been shown to suffer from increased incidence of solid tumors (e.g. colorectal carcinoma), which indicates a reduced immune status. At the same time, their immune system is constantly activated to a state of slight inflammation, likely due to the continuous interaction of leukocytes with the foreign surface of the dialysis filters. In the last decades, several novel antibody drugs have been approved for the treatment of tumors, most of them of the IgG isotype. Major effects of these drugs in defense against tumor cells are mediated through indirect effector mechanisms such as ADCC. These indirect effector mechanisms depend not only on the target cell (tumor) and the antibody but also on the effector cell (leukocyte). It is yet unclear in which way regular hemodialysis influences the leukocytes ability to defend against tumor cells using antibodies. In this study, we investigated this with the mediation of antibodies. We used in vitro methods like 51Cr release assay or immunofluorescence to investigate the in vivo tumor defense and compared DP to healthy individuals (HI). We found an increased ability of DP’s peripheral blood mononuclear cells (PBMC) to kill EGFR coated tumor cells when ADCC was mediated by anti-EGFR antibodies of the IgG2 isotype. When ADCC was mediated by antibodies of the IgG1 isotype, DP and HI showed no significant difference. In order to examine whether the observed effect was restricted to ADCC or also occurred in antibody-dependent phagocytosis by cells such as PMN, we then strove to establish an assay using EGFR-coated microspheres. Principal conductibility and practicability of the chosen method could be demonstrated, and we determined optimal experimental conditions to maximize the observed phagocytosis effect. However, we were unable to show the antibody-dependency of phagocytosis, likely due to an alteration of the EGFR-molecule in the coupling procedure. To investigate further the effect of increased IgG2-mediated ADCC capacity in DP, we then experimented with subpopulations of leukocytes such as monocytes and NK-cells. In the heterogeneous PBMC population, we identified monocytes as the major faction contributing to the observed effect. An expression of FcγRII on the surface of NK-cells of DP or HI could be ruled out. The proportion of monocytes from all PBMC was numerically raised in DP and their monocytes were shown to be more potent in ADCC, suggesting a heightened activation status. The activation of monocytes seems not to be due to changes in the FcR expression, as both DP and HI showed the same level of FcR expression, but seems to be due to an effect downstream the signaling-cascade. Our experiments indicate that cytotoxic effector cells of patients with end-stage renal disease undergoing dialysis are fully capable of antibody mediated tumor cell killing. We did not find any evidence that DP’s ability to perform ADCC is diminished compared to HI. Furthermore, our studies indicate that dialysis patients might profit particularly from certain therapeutic approaches which recruit monocytes as effector cells, such as IgG2 antibodies. Parts of this thesis were published in a paper called “Antibody dependent cellular cytotoxicity in patients on chronic hemodialysis” by Koch et al76, which appeared in the American Journal of Nephrology in 2013.

Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz, welche sich regelmäßiger Hämodialyse unterziehen müssen (dialysis patients, DP), haben ein erhöhtes Risiko, solide Tumoren zu entwickeln, z.B. kolorektale Karzinome. Dies deutet auf einen reduzierten Immunschutz hin, während sich das Immunsystem von DP jedoch andererseits permanent im Zustand einer leichten Aktivierung befindet. Dies liegt u.a. an der Interaktion der Leukozyten mit den fremdartigen Oberflächen der Dialysefilter. In den letzten Jahren haben monoklonale Antikörper als Medikamente gegen Tumoren zunehmend an Bedeutung gewonnen, die meisten vom IgG-Isotyp. Antikörper wirken unter anderem über indirekte Effektormechanismen wie ADCC (antibody dependent cellular cytotoxicity, antikörpervermittelte zelluläre Zytotoxizität). Diese sind nicht nur von der Zielzelle (Tumorzelle) und dem Antikörper abhängig sondern auch vom Effektor (Leukozyt). Es ist noch unklar, auf welche Weise regelmäßige Hämodialyse die Fähigkeit von Leukozyten beeinflusst, mit Hilfe von Antikörpern Tumorzellen zu bekämpfen. Wir untersuchten dies indem wir DP mit gesunden Spendern (healthy individuals, HI) verglichen. In-vitro-Methoden wie 51Cr-release-assay oder Immunfluoreszenz wurden benutzt um die Tumorabwehr in vivo zu simulieren. Wir fanden eine erhöhte ADCC-Kapazität gegen EGFR exprimierende Tumorzellen in den mononukleären Zellen (PBMC) von DP, wenn anti-EGFR Antikörper vom IgG2 Isotyp wie panitumumab eingesetzt wurden. Bei IgG1- Antikörpern unterschied sich die ADCC-Kapazität bei DP und HI dagegen nicht. Um zu untersuchen, ob der beobachtete Effekt auf ADCC begrenzt war oder auch in Antikörper-vermittelter Phagozytose von Fresszellen wie z.B. Neutrophilen (PMN) eine Rolle spielt, begannen wir die Etablierung eines Assays auf Basis von Mikrosphären (beads) mit auf der Oberfläche fixierten EGFR-Molekülen. Die grundlegende Durchführbarkeit der Methode konnte gezeigt und optimale experimentelle Bedingungen definiert werden, doch es gelang uns nicht, die Abhängigkeit der Phagozytose von der Spezifität der IgG2 Antikörper zu zeigen. Um den Effekt der erhöhten IgG2-vermittelten ADCC-Kapazität in Hämodialysepatienten (DP) weiter zu untersuchen, betrachteten wir als nächstes verschiedene Untergruppen von Leukozyten, insbesondere Monozyten und NK-Zellen. Besonders Monozyten schienen an dem beobachteten Effekt beteiligt, eine Expression von FcγRII auf der Oberfläche von NK-Zellen in DP konnte als Ursache ausgeschlossen werden. Der Anteil von Monozyten an PBMC war bei Hämodialysepatienten signifikant erhöht, und die vorhandenen Monozyten zeigten eine erhöhte Lyserate im ADCC, was auf einen erhöhten Aktivierungsstatus hinweist. Diese Aktivierung scheint jedoch nicht auf einer Veränderung der FcR-Expression zu beruhen, sondern auf einen Effekt in einem intrazellulären Abschnitt der Signalkaskade. Unsere Experimente deuten darauf hin dass zytotoxische Effektorzellen von Dialysepatienten in der Lage sind Tumorzellen mit Hilfe von Antikörpern adäquat abzuwehren. Es ergaben sich keine Hinweise dass DP eine verminderte Fähigkeit zum ADCC gegenüber HI besitzen. Zudem deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass Dialysepatienten besonders von Therapieansätzen profitieren könnten, die mit Hilfe von IgG2- Antikörpern auf Monozyten als Effektorzellen beruhen. Teile dieser Doktorarbeit wurden unter dem Titel “Antibody dependent cellular cytotoxicity in patients on chronic hemodialysis” von Koch et al76 im „American Journal of Nephrology“ 2013 publiziert.

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Koch, Till: Indirect effector mechanisms on antibodies in hemodialysis patients. 2015.

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