Auswirkungen ausgewählter Einflussfaktoren auf die genomweite DNA-Methylierung beim Menschen

Gutwein, Jana

Umweltfaktoren können über epigenetische Mechanismen das Expressionsmuster von Genen verändern. So kann eine Veränderung des Lebensstils, z.B. Zigarettenkonsum, durch epigenetische Modifikationen, wie die der DNA-Methylierung, wesentlich zur Pathogenese einiger Erkrankungen beitragen. In der hier vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss des Alters, eines hohen Body Mass Index (BMI), des Rauchens und der Schichtarbeit auf das DNA-Methylierungsmuster von Zwillingen mittels arraybasierter Technologie analysiert und charakterisiert werden. Die Untersuchung von monozygoten Zwillingen hat dabei den Vorteil, dass aufgrund des gleichen genetischen Hintergrundes der Zwillinge, Veränderungen im DNA-Methylierungsmuster den analysierten Parametern zugeschrieben werden können. Aufgrund des auf der primären Fragestellung dieser Arbeit basierenden Studiendesigns, konnte ein zwillingsbasierter Ansatz nur für die Analyse des Einflusses der Schichtarbeit gewählt werden. Für die Parameter Alter, BMI und Rauchen wurde für die Identifizierung einer veränderten DNA-Methylierung eine gruppenbasierte Analyse mittels der sog. False Discovery Rate (FDR, q) bzw. eines definierten Signifikanzwertes bei einer gleichzeitigen Differenz der mittleren Methylierungswerte zwischen zwei Gruppen von mindestens 5% (│∆β│>0,05) durchgeführt. Zusammengefasst wurden folgende Befunde erzielt: 1. Der Infinium HumanMethylation450 BeadChip konnte in einem Vorexperiment erfolgreich etabliert und somit für die anschließenden genomweiten hypothesenfreien DNA-Methylierungsanalysen eingesetzt werden. Diese wurden an aus Zellen des peripheren Blutes isolierter genomischer DNA von monozygoten und dizygoten Zwillingen durchgeführt. 2. Für die Identifizierung altersabhängig methylierter CpG-Loci wurden insgesamt 53 mono- und 63 dizygote DNA-Proben von Zwillingen im Alter von 20–63 Jahren einbezogen. Mittels linearer Regression konnten 111 CpGs bzw. 63 Gene identifiziert werden, deren Methylierung signifikant mit dem Alter korrelierte (q<1x10-11). 47 Gene bzw. 58 Loci konnten dabei die Befunde altersabhängiger Methylierungsveränderungen aus anderen Studien bestätigen, während 16 erstmals neu identifizierte Gene ermittelt werden konnten. Über eine Genontologie-Analyse konnten unter den insgesamt 63 altersabhängig methylierten Genen statistisch signifikante Anreicherungen für Gene ermittelt werden, die an Prozessen des Blutdrucks, der Herzkontraktion und des Nervensystems beteiligt sind. 3. Der Vergleich von fünf adipösen und 29 normalgewichtigen Zwillingen lieferte bei einer FDR q<0,05 drei differentiell methylierte CpGs, die den Genen TREML4 und POM121C zugeordnet werden konnten. Mit einem zweiten Ansatz wurden insgesamt 80 CpGs bzw. 43 Gene ermittelt, deren Methylierung mit einem hohen BMI korrelierte (p<3x10-4; │∆β│>0,05). 3/43 differentiell methylierte Gene (ADORA1, LPGAT1, POM121C) wurden bereits im Zusammenhang mit Adipositas publiziert, während zwei weitere Gene (ADCY5, SYN2) mit einer damit verbundenen Folgeerkrankung, dem Typ-2-Diabetes, assoziiert werden konnten. 4. Der Vergleich von 12 Rauchern und 25 Nichtrauchern resultierte bei einer FDR q<0,05 in insgesamt 22 differentiell methylierten CpGs bzw. 14 Genen. Ein zweiter Ansatz lieferte insgesamt 131 bzw. 68 differentiell methylierte CpG-Loci bzw. Gene (p<4x10-4; │∆β│>0,05). Mit beiden Ansätzen konnten Loci und Gene bestätigt werden, für die andere Studien bereits eine mit dem Rauchen veränderte DNA-Methylierung gezeigt hatten. Insgesamt konnten unter den identifizierten Genen mittels verschiedener Anreicherungsanalysen Gene ermittelt werden, die z.B. in Herzerkrankungen (CACNA1C, GATA4, EVC2, NODAL) und Thrombose (F2RL3, F10), deren Entstehung teilweise durch das Rauchen begünstigt wird, involviert sind. 5. Bei sechs für Nachtarbeit diskordanten Zwillingspaaren konnten insgesamt 21 bzw. elf differentiell methylierte Loci bzw. Gene ermittelt werden (p<0,05; │∆β│≥0,05). Von diesen konnten zehn ausgewählte Loci nicht erfolgreich validiert werden, was primär der geringen statistischen Power zugeschrieben wurde. Dennoch wurden 2/21 Loci bzw. 3/11 Gene (SLC11A1, TMEM132D, TRIM10) bereits in anderen Studien mit einer veränderten Methylierung bei Nachtschichtarbeitern identifiziert, was eine mögliche Auswirkung der Nachtarbeit auf den veränderten Methylierungsstatus dieser Gene unterstreicht. Weiterhin konnten für einige der von differentieller Methylierung betroffenen Gene Assoziationen zu bekannten Risikofaktoren von Schichtarbeit, z.B. dem metabolischen Syndrom (CREB5), erhöhter Anfälligkeit für Infektionen (SLC11A1) sowie Angststörungen (SLC6A1, TMEM132D) gefunden werden. Insgesamt lässt sich schlussfolgern, dass die untersuchten Einflussfaktoren mit spezifischen Veränderungen in der DNA-Methylierung korrelieren. Dabei konnten Loci und Gene aus den einzelnen Teilstudien bestätigt und zumindest die Beteiligung einiger der betroffenen Gene in einen entsprechenden plausiblen biologischen Kontext gebracht werden.

Through epigenetic mechanisms environmental factors are able to change the expression pattern of genes. Thus, a change in lifestyle, such as cigarette consumption, may significantly contribute amongst others to the pathogenesis of some diseases through epigenetic modifications, such as DNA methylation. In the present thesis the influence of age as well as of a high body mass index (BMI), smoking and shiftwork on the DNA methylation pattern of twins should be analyzed and characterized through an array-based approach. Investigation of monozygotic twins offers the advantage that due to the identical genetic background of these twins, changes in DNA methylation patterns can be attributed to the analyzed parameters. Due to the study design based on the primary question of this thesis, a twin-based approach could be used only for the analysis of the influence of shiftwork. For the parameters age, BMI and smoking a group-based approach was used for the identification of changes in DNA methylation by applying the false discovery rate (FDR, q) and a defined level of significance with a simultaneously difference of the mean methylation values between two groups of at least 5% (│∆β│>0.05), respectively. Summarized the following results were obtained: 1. The Infinium HumanMethylation450 BeadChip could be successfully validated in a pre-experiment and could therefore be used for subsequent genome-wide hypothesis free DNA methylation analyses. These were performed in whole blood genomic DNA from monozygotic and dizygotic twins. 2. For identification of age dependent methylated CpG loci a total of 53 monozygotic and 63 dizygotic DNA samples of twins at age of 20–63 years were included. By using the linear regression model 111 CpGs and 63 genes, respectively, could be identified whose methylation significantly correlated with age (q<1x10-11). 47 genes and 58 loci, respectively, could be confirmed that have already been related to an age-dependent methylation by previous studies whereas 16 newly identified genes could be detected. Performing gene ontology analysis for the 63 age-dependent methylated genes, statistically significant enrichments could be found for genes involved in processes of blood pressure, heart contraction and nervous system. 3. The comparison of five obese and 29 normal weighted twins resulted in three differentially methylated CpGs associated with the genes TREML4 and POM121C by applying a FDR q<0.05. In a second approach a total of 80 CpGs and 43 genes, respectively, could be identified that correlated with a high BMI (p<3x10-4; │∆β│>0.05). 3/43 differentially methylated genes (ADORA1, LPGAT1, POM121C) were already published with association to adiposity whereas two further genes (ADCY5, SYN2) could be associated with a secondary disease, type 2 diabetes. 4. The comparison of 12 smokers and 25 nonsmokers resulted in a total of 22 differentially methylated CpGs and 14 genes, respectively, by applying a FDR q<0.05. A second approach resulted in a total of 131 and 68 differentially methylated CpG loci and genes, respectively (p<4x10-4; │∆β│>0.05). With both approaches loci and genes could be confirmed of which other studies have already reported an altered DNA methylation due to tobacco smoking. All in all, with different enrichment analyses differentially methylated genes could be detected to be involved in e.g. heart diseases (CACNA1C, GATA4, EVC2, NODAL) and thrombosis (F2RL3, F10) whose development is partially promoted by smoking. 5. In six twin pairs discordant for night work a total of 21 and eleven differentially methylated loci and genes, respectively, could be detected (p<0.05; │∆β│≥0.05). For ten selected loci validation failed which may be attributed to low statistical power. However, 2/21 loci and 3/11 genes (SLC11A1, TMEM132D, TRIM10), respectively, have already been identified in night shift workers with an altered DNA methylation by other studies, emphasizing a possible effect of night work on the methylation of these genes. Furthermore, for some of the differentially methylated genes associations to known risk factors of shiftwork such as the metabolic syndrome (CREB5), increased susceptibility to infections (SLC11A1) and anxiety disorders (SLC6A1, TMEM132D) could be found. All in all it can be concluded that the investigated influence factors correlate with specific alterations in DNA methylation. Loci and genes from substudies could be confirmed and at least involvement of some of the affected genes may be plausible in the relevant biological context.

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Gutwein, Jana: Auswirkungen ausgewählter Einflussfaktoren auf die genomweite DNA-Methylierung beim Menschen. 2015.

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