Untersuchungen zu Struktur-Aktivitäts-Beziehungen am mARC-Enzymsystem

Bauch, Eva

Die mitochondriale Amidoxim Reduzierende Komponente (mARC) wurde 2006 als viertes Molybdoenzym neben der Sulfitoxidase, Xanthinoxidoreduktase und Aldehydoxidase im menschlichen Organismus identifiziert. Gemeinsam mit Cytochrom b5 und Cytochrom b5 Reduktase bildet mARC ein Enzymsystem, welches die N-Reduktion zahlreicher N-hydroxylierter bzw. N-oxygenierter Verbindungen katalysiert und somit an der Aktivierung von Prodrugs und Inaktivierung von Arzneistoffen in vivo beteiligt ist. Ziel dieser Arbeit war es, Struktur-Aktivitäts-Beziehungen am mARC-Enzymsystem zu untersuchen. Anhand unterschiedlich substituierter Derivate des Modellsubstrats Benzamidoxim konnte gezeigt werden, dass die elektronischen Eigenschaften des Substituenten in para-Position, dargestellt durch die Hammett-Konstante, die physikochemischen Eigenheiten der Amidoximfunktion, repräsentiert durch die chemischen Verschiebungen im 1 H-NMR und die Redoxpotentiale, beeinflussen. Zur Charakterisierung der enzymatischen Reduktion dieser Verbindungen wurden die kinetischen Parameter KM und Vmax unter Verwendung der äußeren mitochondrialen Membranfraktion der Schweineleber sowie des humanen mARC1- bzw. mARC2-haltigen rekombinanten Enzymsystems als Proteinquelle bestimmt. Mittels Korrelationsanalyse konnte gezeigt werden, dass die hierbei detektierten Unterschiede weder durch die elektronischen Eigenschaften der Substituenten noch deren Lipophilie begründet sind. Bei der rationalen Entwicklung neuer Amidoxim-Prodrugs können diese Substituenteneigenschaften somit zumindest hinsichtlich der Bioaktivierung vernachlässigt werden. Elektronenziehende Substituenten begünstigten die elektrochemische Reduktion der untersuchten para-substituierten Benzamidoxime, nicht jedoch die enzymatische, mARC-katalysierte Reduktion. Das Redoxverhalten von humanem mARC1 wurde mittels direkter Proteinelektrochemie analysiert und ein Prozess detektiert, an dem zwei Elektronen und zwei Protonen beteiligt waren. Die mARC-vermittelte Inaktivierung N-hydroxylierter Sulfonamide, Entwicklungsprodukte aus der Klasse neuartiger HNO-Donoren zur Therapie kardiovaskulärer Erkrankungen, wurde verglichen. Erste Hypothesen zu Struktur-Aktivitäts-Beziehungen konnten formuliert werden, welche in weiteren Studien zu überprüfen sind. Am Beispiel von 4-Nitrobenzamidoxim, 4-Nitrobenzamidin und Nitrobenzol konnte gezeigt werden, dass Nitrogruppen aromatischer Verbindungen unter aeroben Bedingungen nicht durch das mARC-Enzymsystem reduziert werden.

The mitochondrial Amidoxime Reducing Component (mARC) was identified in 2006 as the fourth molybdenum containing enzyme besides sulfitoxidase, xanthinoxidase, and aldehydoxidase in humans. Together with cytochrome b5 and cytochrome b5 reductase, mARC forms an enzyme system which catalyzes the N-reduction of numerous N-hydroxylated and N-oxygenated compounds and is thus involved in activation of prodrugs and inactivation of drugs in vivo. This study was conducted to gain knowledge about structure-activity relationships of the mARC-containing enzyme system. The influence of the electronic properties of the substituent in para-position, representated by Hammett´s σ, on the physicochemical properties of the amidoxime function, representated by the chemical shifts in 1 H-NMR and the redox potentials, was demonstrated using several derivatives of the model substrate benzamidoxime. The kinetic parameters KM and V max of the enzymatic reduction of these compounds were determined using outer mitochondrial membrane vesicles of porcine liver as well as the human mARC1- and mARC2-containing recombinant enzyme system. Correlation analysis led to the conclusion that differences detected for KM and V max are not due to the electronic properties or the lipophilicity of the substituents. Thus, these substituent properties can be ignored during the rational development of new amidoxime prodrugs, at least regarding bioactivation. Electron-withdrawing substituents facilitated the electrochemical reduction of the investigated para-substituted benzamidoximes, but not the enzymatic, mARC-catalyzed reduction. The redox behavior of recombinant mARC1 was studied by direct proteinelectrochemistry and a process was detected in which two electrons and two protons were involved. The mARC-mediated inactivation of N-hydroxylated sulfonamides, new drug candidates belonging to the class of HNO-donors for the treatment of cardiovascular diseases, was investigated. As a result, first assumptions about structure-activity relationships were formulated which need to be verified by further research. Regarding 4-nitrobenzamidoxime, 4-nitrobenzamidine, and nitrobenzene, it could be demonstrated that the mARC-containing enzyme system is not capable of reducing nitro groups of aromatic compounds under aerobic conditions.

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Bauch, Eva: Untersuchungen zu Struktur-Aktivitäts-Beziehungen am mARC-Enzymsystem. 2015.

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